Mise en place d'un<em> In vitro</em> Système d'étudier le comportement intracellulaire de<em> Candida glabrata</em> En droits macrophages THP-1
Summary
Le présent article décrit un protocole pour établir un système de modèle de culture cellulaire in vitro pour étudier l'interaction d'un champignon pathogène intracellulaire facultatif humain Candida glabrata avec les macrophages humains qui sera un outil utile pour faire progresser notre connaissance des mécanismes de virulence des champignons.
Abstract
Un système modèle de culture cellulaire, si un synoptique proche des conditions d'environnement de l'hôte, peut servir comme une alternative peu coûteuse, facilement manipulable et reproductible pour des systèmes de modèles animaux pour l'étude d'une étape spécifique de l'infection par le pathogène microbien. Une lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1 qui, lors du traitement de l'ester de phorbol, se différencie en macrophages, a déjà été utilisé pour étudier les stratégies de virulence de nombreux pathogènes intracellulaires, y compris Mycobacterium tuberculosis. Ici, nous discutons d'un protocole d'adopter un modèle in vitro de culture cellulaire dans système à l'aide de macrophages THP-1 pour délimiter l'interaction d'un agent pathogène opportuniste humain de la levure Candida glabrata avec des cellules phagocytaires de l'hôte. Ce système de modèle est simple, rapide, prête à écrans mutantes à haut débit, et ne nécessite pas de matériel sophistiqué. Un THP-1 expérience d'infection des macrophages typique prend environ 24 heures avec un 24-48 heures supplémentaires pour permettre intracellulaire récupérélevure de se développer sur un milieu riche pour colony forming analyse de la viabilité à base de parts. Comme d'autres systèmes modèles in vitro dans une éventuelle limitation de cette approche est la difficulté d'extrapoler les résultats obtenus à un circuit de cellule immunitaire très complexe existant dans l'hôte humain. Cependant, malgré cela, le protocole actuel est très utile pour élucider les stratégies d'un agent pathogène fongique peut employer pour échapper / contrecarrer réponse antimicrobienne et survivre, s'adapter, et de proliférer dans l'environnement pauvre en nutriments des cellules immunitaires de l'hôte.
Introduction
Espèces de Candida sont la principale cause des infections fongiques invasives potentiellement mortelles chez les patients immunodéprimés 1. Candida glabrata, un pathogène nosocomial émergents, est la deuxième ou troisième plus fréquemment isolés espèces de Candida chez des patients de l'unité de soins intensifs en fonction de la situation géographique 1-3. Phylogénétiquement, C. glabrata, une levure bourgeonnante haploïde, est plus étroitement liée aux Saccharomyces non pathogène modèle cerevisiae que de pathogène Candida spp., y compris C. albicans 4. Conformément à cela, C. glabrata manque quelques traits de virulence fongiques clés, y compris l'accouplement, l'activité protéolytique sécrétée et la plasticité morphologique 4-5.
Bien que C. glabrata ne fait pas hyphes, il peut survivre et se répliquer dans les macrophages murins et humains 6-8 suggérant qu'il a développé des mécanismes de pathogenèse uniques. Peu d'informations sont disponibles sur les stratégies que C. glabrata emploie pour survivre environnement macrophages intracellulaire pauvres en éléments nutritifs et de contrer oxydation et réponses de l'hôte non oxydants montés par les cellules immunitaires de l'hôte 5. Un système de modèle de macrophage pertinente est une condition préalable pour délimiter l'interaction de C. glabrata avec des cellules phagocytaires de l'hôte par des approches génomiques et protéomiques fonctionnels. Les cellules mononucléées du sang (PBMC) et des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) d'origine humaine et murine, respectivement, ont précédemment été utilisées pour étudier l'interaction de C. glabrata avec des cellules immunitaires de l'hôte 7,9. Cependant, la difficulté à obtenir les CMSP et BMDMs, leur durée de vie limitée et variation intrinsèque entre les différents bailleurs de fonds de mammifères limitent l'utilisation de ces cellules des systèmes modèles comme polyvalents.
Ici, nous décrivons une méthode pour l'établissement d'un système in vitro pour étudier la intracellulcomportement ar de C. glabrata cellules dans les macrophages issus de la lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1. L'objectif global de ce protocole était d'adopter un système de modèle de culture cellulaire simple, peu coûteux, rapide et reproductible qui peut être facilement manipulé pour étudier différents aspects du pathogène interaction hôte-fongique.
Cellules THP-1 ont déjà été utilisées pour déchiffrer la réponse immunitaire de l'hôte contre une large gamme d'agents pathogènes, notamment des bactéries, des virus et des champignons 10-12. Cellules monocytaires THP-1 sont faciles à entretenir et peuvent être différenciées, par traitement de l'ester de phorbol, de macrophages qui imitent les macrophages dérivés de monocytes humains et des macrophages expriment des marqueurs appropriés 13. Les principaux avantages de THP-1 système de modèle de macrophage sont la facilité d'usage et l'absence d'exigence d'un équipement sophistiqué.
Le protocole présenté ici est facilement adaptable pour étudier l'interaction d'autres agents pathogènes fongiques humains avec host cellules immunitaires. La procédure de courant peut également être utilisée pour identifier des facteurs de virulence de l'agent pathogène d'intérêt en utilisant des écrans de mutants à haut débit. Cette preuve de concept a été illustré par l'utilisation réussie de THP-1 système de modèle de culture pour identifier un ensemble de 56 gènes qui sont nécessaires pour la survie de C. glabrata dans les macrophages humains 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Système immunitaire inné joue un rôle important dans le contrôle des infections fongiques opportunistes. Macrophages contribuent à la défense antifongique par ingestion et la destruction de l'agent pathogène fongique. Ainsi, l'élucidation des facteurs qui sont nécessaires pour la survie et / ou contrecarrer les fonctions antimicrobiennes des macrophages fera progresser notre compréhension des stratégies de virulence des champignons. Dans ce contexte, nous avons établi un système modèle in vitro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par Innovative jeune biologiste Prix BT/BI/12/040/2005 et BT/PR13289/BRB/10/745/2009 subvention du Département de biotechnologie, gouvernement de l'Inde et les ressources de base de Centre pour empreintes génétiques et diagnostics, Hyderabad. MRN et GB sont les bénéficiaires de bourses de recherche junior et senior du Conseil de recherche scientifique et industrielle vers la poursuite d'un diplôme de l'Université de Manipal de doctorat. SB est le récipiendaire du Junior et Senior Research Fellowship du Département de biotechnologie vers la poursuite d'un diplôme de l'Université de Manipal de doctorat.
Materials
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Human acute monocytic leukemia cell line |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | For maintaining THP-1 cells |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | Caution: Hazardous |
| YPD | BD-Difco | 242710 | For growing Candida glabrata cells |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4) for washes | ||
| Saline-sodium citrate (SSC) | Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes | ||
| Prehybridization buffer | Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization | ||
| VECTASHIELD mounting medium | Vector Labs | H-1200 | For mounting slides for confocal microscopy |
| 32P-labeled α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | For radiolabeling of signature tags |
| 100 mm tissue culture dishes | Corning | 430167 | To culture THP-1 cells |
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3527 | To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages |
| 4-chamber tissue culture-treated glass slide | BD Falcon | REF354104 | To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Hemocytometer | Rohem India | For enumeration of cells | |
| Table top microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 18 | For spinning down cells in microtubes |
| Table top centrifuge | Remi | R-8C | For spinning down cells in 15 ml tubes |
| Spectrophotometer | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | To monitor absorbance of yeast cells |
| Plate incubator | Labtech | Refrigerated | To grow C. glabrata cells |
| Shaker incubator | New Brunswick | Innova 43 | To grow C. glabrata cells |
| Water jacketed CO2 incubator | Thermo Electron Corporation | Forma series 2 | To culture THP-1 cells |
| Confocal microscope | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Compound microscope | Olympus | CKX 41 | To observe C. glabrata and THP-1 macrophages |
| PCR machine | BioRad | DNA Engine | To amplify unique tags from input and output genomic DNA |
| Hybridization oven | Labnet | Problot 12S | For hybridization |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | For scanning hybridized membranes |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | For denaturation of radiolabeled signature tags |
| Gel documentation unit | Alphainnontech | Alphaimager | To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels |
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