Mise en place d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Système d&#39;étudier le comportement intracellulaire de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En droits macrophages THP-1

Résumé

Le présent article décrit un protocole pour établir un système de modèle de culture cellulaire in vitro pour étudier l'interaction d'un champignon pathogène intracellulaire facultatif humain Candida glabrata avec les macrophages humains qui sera un outil utile pour faire progresser notre connaissance des mécanismes de virulence des champignons.

Résumé

Un système modèle de culture cellulaire, si un synoptique proche des conditions d'environnement de l'hôte, peut servir comme une alternative peu coûteuse, facilement manipulable et reproductible pour des systèmes de modèles animaux pour l'étude d'une étape spécifique de l'infection par le pathogène microbien. Une lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1 qui, lors du traitement de l'ester de phorbol, se différencie en macrophages, a déjà été utilisé pour étudier les stratégies de virulence de nombreux pathogènes intracellulaires, y compris Mycobacterium tuberculosis. Ici, nous discutons d'un protocole d'adopter un modèle in vitro de culture cellulaire dans système à l'aide de macrophages THP-1 pour délimiter l'interaction d'un agent pathogène opportuniste humain de la levure Candida glabrata avec des cellules phagocytaires de l'hôte. Ce système de modèle est simple, rapide, prête à écrans mutantes à haut débit, et ne nécessite pas de matériel sophistiqué. Un THP-1 expérience d'infection des macrophages typique prend environ 24 heures avec un 24-48 heures supplémentaires pour permettre intracellulaire récupérélevure de se développer sur un milieu riche pour colony forming analyse de la viabilité à base de parts. Comme d'autres systèmes modèles in vitro dans une éventuelle limitation de cette approche est la difficulté d'extrapoler les résultats obtenus à un circuit de cellule immunitaire très complexe existant dans l'hôte humain. Cependant, malgré cela, le protocole actuel est très utile pour élucider les stratégies d'un agent pathogène fongique peut employer pour échapper / contrecarrer réponse antimicrobienne et survivre, s'adapter, et de proliférer dans l'environnement pauvre en nutriments des cellules immunitaires de l'hôte.

Introduction

Espèces de Candida sont la principale cause des infections fongiques invasives potentiellement mortelles chez les patients immunodéprimés ^1. Candida glabrata, un pathogène nosocomial émergents, est la deuxième ou troisième plus fréquemment isolés espèces de Candida chez des patients de l'unité de soins intensifs en fonction de la situation géographique ^1-3. Phylogénétiquement, C. glabrata, une levure bourgeonnante haploïde, est plus étroitement liée aux Saccharomyces non pathogène modèle cerevisiae que de pathogène Candida spp., y compris C. albicans ^4. Conformément à cela,

Protocole

Il est recommandé d'effectuer C. glabrata expériences d'infection dans un laboratoire avec un niveau de biosécurité de confinement 2 (BSL-2).

1. Préparation des cellules THP-1 macrophage monocouche.
2. C. Préparation d' glabrata suspension cellulaire.
3. L'infection des macrophages THP-1 avec C. cellules glabrata.
4. Mesure du taux de phagocytose et de la réplication intracellulaire par l'intermédiaire de formation de colonies dosage unitaire.
5. Surveillance de la réplication intracellulaire en utilisant la microscopie confocale à balayage laser.

Résultats

Analyse infection de PMA-traités macrophages THP-1 avec C. les cellules de type sauvage glabrata (wt) ont révélé que les cellules wt ont été phagocytés par des macrophages à un taux de 55-65% au bout de 2 h co-incubation. En outre, C. glabrata cellules étaient capables de résister à mort par les macrophages THP-1 et ont subi une moyenne de 5 - à 7 fois plus dans UFC après 24 heures de co-culture avec des macrophages THP-1 ^8. La réplication intracellulaire de cellules de typ.......

Discussion

Système immunitaire inné joue un rôle important dans le contrôle des infections fongiques opportunistes. Macrophages contribuent à la défense antifongique par ingestion et la destruction de l'agent pathogène fongique. Ainsi, l'élucidation des facteurs qui sont nécessaires pour la survie et / ou contrecarrer les fonctions antimicrobiennes des macrophages fera progresser notre compréhension des stratégies de virulence des champignons. Dans ce contexte, nous avons établi un système modèle in vitro de cultu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
THP-1	American Type Culture Collection	TIB 202	Lignée cellulaire de leucémie monocytaire aiguë humaine
RPMI-1640	Hyclone	SH30096.01	Pour maintenir les cellules THP-1
Phorbol 12-myristate 13-acétate	Sigma-Aldrich	P 8139	Attention : Dangereux
YPD  ;	BD-Difco	242710	Pour la culture de cellules Candida glabrata
Formaldéhyde	Sigma-Aldrich	F8775	Pour la fixation des macrophages THP-1 C. glabrata infectés par
phosphate Tampon salin tamponné au phosphate (PBS)			Tampon (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2,7 mM KCl,  ; pH 7,4) pour lavages Citrate salin-sodique
(SSC)  ;			Tampon (3 M NaCl, 0,3 M de citrate de sodium pour une concentration de 20x) pour lavages Tampon
		préhybridation	Tampon (50 % formamide, 5x Denhardt' s, 5x SSC, 1 % SDS) pour l’hybridation
Support de montage VECTASHIELD	Vector Labs	H-1200	Pour le montage de lames pour la microscopie confocale
32P labellisé &alpha ;-dCTP	JONAKI-BARC	LCP-102	Pour le radiomarquage des étiquettes de signature
Boîtes de culture tissulaire de 100 mm	Corning	430167	Pour la culture de cellules THP-1
Plaque de culture tissulaire à 24 puits	Corning	3527	Réalisation d’études sur l’infection C. glabrata dans les macrophages THP-1
Lame de verre traitée par culture tissulaire à 4 chambres	BD Falcon REF354104		Pour imager les macrophages THP-1 infectés par C. glabrata
Hemocytomètre	Rohem Inde		Pour le dénombrement des cellules
Microcentrifugeuse de table	Beckman Coulter	Microfuge 18	Pour la rotation de cellules dans des microtubes
Centrifugeuse de table	Remi	R-8C	Pour la rotation de cellules dans des tubes de 15 ml
Spectrophotomètre	Amersham Biosciences	Ultraspec 10	Pour surveiller l’absorbance des cellules de levure
Incubateur à plaques	Labtech	Réfrigéré	Pour cultiver des cellules C. glabrata
Incubateur Agitateur	Nouveau-Brunswick	Innova 43	Pour cultiver des cellules C. glabrata
Enveloppe d’eau CO2 incubateur	Thermo Electron Corporation	Forma series 2	Pour cultiver des cellules THP-1
Microscope confocal	Carl Ziess	Ziess LSM 510 meta	Pour observer les macrophages THP-1 C. glabrata infectés par
Microscope composé	Olympus	CKX 41	Pour observer les macrophages C. glabrata et THP-1
Machine PCR	BioRad	Engine	Pour amplifier des marqueurs uniques à partir de l’entrée et de la sortie de l’ADN génomique
Four d’hybridation	Labnet	Problot 12S	Pour l’hybridation  ;
PhosphorImager	Fujifilm	FLA-9000	Pour le balayage de membranes hybrides
Thermomixeur	Eppendorf	Thermomixer Confort	Pour la dénaturation de marqueurs de signature radiomarqués
Unité de documentation sur gel Alphainnontech		Alphaimager	Pour visualiser l’ADN coloré au bromure d’éthidium dans les gels d’agarose

le de l’eau DNA