Analyse af Fatty Acid indhold og sammensætning i mikroalger

Summary

En metode til bestemmelse af fedtsyreindhold og sammensætning i mikroalger baseret på mekanisk celle forstyrrelser, opløsningsmiddelbaseret lipidekstraktion, transesterificering, og kvantificering og identifikation af fedtsyrer ved hjælp af gaskromatografi beskrives. En tripentadecanoin intern standard bruges til at kompensere for eventuelle tab i udvinding og ufuldstændig transesterificering.

Abstract

En metode til at bestemme indholdet og sammensætningen af ​​fedtsyrer i alt til stede i mikroalger er beskrevet. Fedtsyrer er en vigtig bestanddel af mikroalger biomasse. Disse fedtsyrer kan være til stede i forskellige acyl-lipid-klasser. Især fedtsyrerne i triacylglycerol (TAG) er af kommerciel interesse, fordi de kan bruges til produktion af transportbrændstof, bulk kemikalier, nutraceuticals (ω-3 fedtsyrer) og fødevarer råvarer. At udvikle kommercielle applikationer, er der behov for pålidelige analysemetoder til kvantificering af fedtsyreindhold og sammensætning. Mikroalger er enkelte celler omgivet af en stiv cellevæg. En fedtsyre analysemetode bør give tilstrækkelig cellesprængning at løslade alle acyl lipider og ekstraktionsmetode, der anvendes, bør være i stand til at udtrække alle acyl lipidklasser.

Med den metode, der præsenteres her alle fedtsyrerne i mikroalger kan være præcist og reproducerbart idenceret og kvantificeres ved hjælp af små mængder af prøven (5 mg) uafhængig af deres kædelængde, umætningsgrad eller lipid klasse, de er en del af.

Denne metode giver ikke oplysninger om den relative forekomst af forskellige lipidklasser, men kan udvides til at adskille lipidklasser fra hinanden.

Metoden er baseret på en sekvens af mekanisk celle forstyrrelser, opløsningsmiddelbaseret lipidekstraktion, omestring af fedtsyrer til methylesterolier (fames), og kvantificering og identifikation af FAMEs anvender gaskromatografi (GC-FID). En TAG intern standard (tripentadecanoin) tilsættes før den analytiske procedure for at korrigere for tab under udvinding og ufuldstændig transesterificering.

Introduction

Fedtsyrer er en af de vigtigste bestanddele af mikroalger biomasse og udgør typisk mellem 5-50% af cellens tørvægt ^1-3. De er hovedsageligt til stede i form af glycerolipider. Disse glycerolipider gengæld består hovedsageligt af phospholipider, glycolipider og triacylglycerol (TAG). Især fedtsyrerne i TAG er af kommerciel interesse, fordi de kan bruges som en ressource til produktion af transportbrændstof, bulk kemikalier, nutraceuticals (ω-3 fedtsyrer) og fødevarer råvarer ^3-6. Mikroalger kan vokse i havvand baseret vækstmediers, kan have en meget højere areal produktivitet end landplanter, og kan dyrkes i fotobioreaktorer på steder, der er uegnet til landbrug, måske endda offshore. Af disse grunde er mikroalger ofte betragtet som et lovende alternativ til terrestriske planter til produktion af biodiesel og andre bulkvarer ^3-6. Potentielt ingen landbrugs log eller frisk vand (når dyrkes i lukkede fotobioreaktorer, eller når der bruges marine mikroalger) er nødvendig for deres produktion. Derfor er biobrændstoffer, der stammer fra mikroalger betragtet ^3. generations biobrændstoffer.

Det samlede cellulære indhold af fedtsyrer (% tørvægt), lipid-klasse sammensætning, såvel som fedtsyren længde og graden af ​​mætning varierer meget mellem mikroalger arter. Desuden er disse egenskaber varierer med dyrkningsbetingelserne såsom tilgængeligheden af næringsstoffer, temperatur, pH og lysintensitet ^1,2. For eksempel, når de udsættes for kvælstof sult, kan mikroalger akkumulere store mængder af TAG. Under optimale vækstbetingelser TAG udgør typisk mindre end 2% af tørvægt, men når de udsættes for nitrogenudsultning TAG indhold kan stige til op til 40% af mikroalger tørvægt ^1.

Mikroalger primært producerer fedtsyrer med kædelængder af 16 og 18carbonatomer, men nogle arter kan gøre fedtsyrer op til 24 carbonatomer i længde. Både mættede samt yderst umættede fedtsyrer er produceret af mikroalger. Sidstnævnte omfatter fedtsyrer med ernæringsmæssige fordele (ω-3 fedtsyrer) som C20: 5 (eicosapentaensyre, EPA) og C22: 6 (docosahexaensyre, DHA) for hvilke der ikke vegetabilske alternativer ^1,2,4,7. Den (distribution af) fedtsyre kædelængde og mætningsgrad bestemmer også egenskaber og kvalitet af alger-afledte biobrændstoffer og spiseolier ^4,8.

At udvikle kommercielle anvendelser af mikroalger afledt fedtsyrer, er der behov for pålidelige analysemetoder til kvantificering af fedtsyreindhold og sammensætning.

Som også påpeget af Ryckebosch et al. ^9, analyse af fedtsyrer i mikroalger adskiller sig fra andre substrater (fx vegetabilsk olie, fødevarer, dyrevæv osv.) væreforårsage 1) mikroalger er enkelte celler omgivet af stive cellevægge komplicerer lipidekstraktion 2) mikroalger indeholde en bred vifte af lipidklasser og lipid-klasse fordelingen er meget variabel ^7. Disse forskellige lipidklasser har en lang række i kemisk struktur og egenskaber, såsom polaritet. Også andre end acyl lipider lipidklasser produceret 3) mikroalger indeholde en bred vifte af fedtsyrer, der spænder fra 12 til 24 carbonatomer i længde og indeholder både mættede samt yderst umættede fedtsyrer. Derfor udviklede metoder til at analysere fedtsyrer bortset mikroalger substrater måske ikke være egnet til at analysere fedtsyrer mikroalger.

Som gennemgået af Ryckebosch et al. ^9, den vigtigste forskel mellem almindeligt anvendte lipidekstraktion procedurer er i opløsningsmiddel-systemer, der anvendes. På grund af det store udvalg af lipidklasser stede i mikroalger, der hver har forskellig polaritet, den ekstraheredelipid mængde vil variere med opløsningsmidler ^10-12. Dette fører til uoverensstemmelser i lipid-indhold og sammensætning præsenteret i litteraturen ^9,10. Afhængigt af den anvendte opløsningsmiddelsystem, metoder baseret på opløsningsmiddelekstraktion uden cellesprængning gennem for eksempel perle hjerteslag eller lydbehandling, kan ikke udtrække alle lipider på grund af den stive konstruktion af nogle mikroalger arter ^9,13. I tilfælde af ufuldstændig lipidekstraktion kan ekstraktionseffektiviteten af de forskellige lipidklasser variere ^14. Dette kan også have en effekt på det målte fedtsyresammensætning, fordi fedtsyresammensætningen er variabel blandt lipidklasser ^7.

Vores fremgangsmåde er baseret på en sekvens af mekanisk cellesprængning, opløsningsmiddelbaseret lipidekstraktion transesterificering af fedtsyrerne til fedtsyremethylestere (FAMEs) og kvantificering og identifikation af FAMEs anvender gaskromatografi i kombination med en flamme ionization detektor (GC-FID). En intern standard i form af en triacylglycerol (tripentadecanoin) tilsættes før den analytiske procedure. Mulige tab i udvinding og ufuldstændig transesterificering kan derefter korrigeres for. Fremgangsmåden kan anvendes til at bestemme indhold samt sammensætningen af ​​fedtsyrerne i mikroalger biomasse. Alle fedtsyrerne i de forskellige acyl-lipid klasser, herunder oplagring (TAG) samt membran lipider (glycolipider, phospholipider), der opdages, identificeres og kvantificeres præcist og reproducerbart ved denne metode kun bruger små mængder prøve (5 mg) . Denne metode giver ikke oplysninger om den relative forekomst af forskellige lipidklasser. Imidlertid kan fremgangsmåden udvides til at adskille lipidklasser fra hinanden ^1. Koncentrationen og fedtsyresammensætningen af ​​de forskellige lipidklasser kan derefter bestemmes individuelt.

I litteraturen flere andre metoder erbeskrevet at analysere lipider mikroalger. Nogle metoder fokuserer på de samlede lipofile komponenter ^15, mens andre metoder fokus på fedtsyrer i alt ^9,16. Disse alternativer omfatter gravimetrisk bestemmelse af det samlede ekstraherede lipider, direkte trans-forestring af fedtsyrer kombineret med kvantificering ved hjælp af kromatografi og farvning celler med lipofile fluorescerende farvestoffer.

En almindeligt anvendt alternativ til kvantificering af fedtsyrer ved hjælp af kromatografi er kvantificering af lipider under anvendelse af en gravimetrisk bestemmelse ^17,18. Fordele ved en gravimetrisk bestemmelse er manglen på krav til avancerede og dyre udstyr som en gaskromatograf, let at sætte op proceduren på grund af tilgængeligheden af standardiserede analytiske udstyr (f.eks Soxhlet), og en gravimetrisk bestemmelse er mindre tidskrævende end kromatografi baserede metoder. Den største fordel ved at anvende kromatografi metoder på othare side er, at kun fedtsyrer i en sådan fremgangsmåde måles. I en gravimetrisk bestemmelse ikke-fedtsyre indeholdende lipider, ligesom pigmenter eller steroider, er også medtaget i opgørelsen. Disse ikke-fedtsyre indeholdende lipider kan udgøre en stor del (> 50%) af de samlede lipider. Hvis man kun er interesseret i fedtsyre-indhold (for eksempel til anvendelser biodiesel), vil det være overvurderet, når en gravimetrisk bestemmelse anvendes. Hertil kommer, i en gravimetrisk bestemmelse nøjagtigheden af ​​den analytiske balance bruges til at afveje de udtrukne lipider bestemmer prøvens størrelse, der skal bruges. Denne mængde er typisk meget mere end den mængde, der kræves, når kromatografi anvendes. Endelig er en anden fordel ved at anvende kromatografi over gravimetrisk bestemmelse er, at chromatografi giver oplysninger om fedtsyresammensætningen.

Et andet alternativ til vores præsenterede metode er direkte transesterificering ^16,19,20.I denne metode lipidekstraktion og transesterificering af fedtsyrer til FAMEs kombineres i én arbejdsgang. Denne fremgangsmåde er hurtigere end en separat udvinding og transesterificering skridt, men at kombinere disse trin begrænser de opløsningsmidler, der kan anvendes til ekstraktion. Dette kan have en negativ indflydelse udsugningseffektivitet. En anden fordel ved en særskilt lipidekstraktion og transesterifikation skridt er, at det giver mulighed for en ekstra lipid klasse adskillelse mellem disse trin ^1. Dette er ikke muligt, når direkte transesterificering anvendes.

Andre almindeligt anvendte metoder til at bestemme fedtindholdet i mikroalger omfatte farvning biomassen med lipofile fluorescerende pletter såsom Nile rød eller BODIPY og måle fluorescens signal ^21,22. En fordel ved disse metoder er, at de er mindre arbejdskrævende end alternative metoder. En ulempe ved disse metoder er, at fluorescerende respons er af forskellige grunde, variabel mellem species, dyrkningsforhold, lipidklasser og analytiske procedurer. Som et eksempel, er flere af disse variationer skyldes forskelle i optagelse af farvestoffet ved mikroalger. Kalibrering med en anden kvantitativ metode er derfor nødvendigt, fortrinsvis udført for alle de forskellige dyrkningsbetingelser og vækststadier. Endelig virker denne metode ikke give oplysninger om fedtsyresammensætningen og er mindre nøjagtige og reproducerbare end kromatografi baserede metoder.

Den præsenterede metode er baseret på den beskrevet af Lamers et al. ²³ og Santos et al. ^24-metoden og er også blevet anvendt af forskellige andre forfattere ^1,25-27. Også andre metoder er til rådighed, der er baseret på de samme principper, og kunne give lignende resultater ^9,28.

Protocol

1.. Prøveforberedelse Der er to alternative protokoller for prøveforberedelse indgår som trin 1.1 og 1.2. Begge metoder er lige så egnede og giver lignende resultater, men hvis en begrænset mængde af alger kultur volumen er tilgængelig, anbefalede metode 1.1. BEMÆRK: For enten protokol, forberede yderligere to perle beater rør i henhold til protokollen for hele men uden at tilføje alger til dem for at blive brugt som en blank. På denne måde kan toppe i …

Representative Results

Et typisk kromatogram, som opnås via denne proces er vist i figur 1. FAMEs er adskilt af størrelse og graden af ​​mætning af GC-kolonne og protokol, der anvendes. Kortere kædelængde fedtsyrer og mere mættede fedtsyrer (færre dobbeltbindinger) har kortere retentionstider. Den anvendte GC-kolonne og protokol har ikke til hensigt at adskille fedtsyreisomerer (samme kædelængde og grad af mætning, men forskellige positioner dobbeltbindinger), men dette kunne opnås ved hjælp af en anden GC-kol…

Discussion

Den beskrevne fremgangsmåde kan anvendes til at bestemme indholdet samt sammensætningen af ​​totale fedtsyrer er til stede i mikroalger biomasse. Fedtsyrer afledt fra alle lipidklasser, herunder oplagring (TAG) samt membranlipider (phospholipider og glycolipider), opdages. Alle fedtsyrekædelængder og grader af mætning, der er til stede i mikroalger kan påvises og skelnes. Metoden er baseret på mekanisk celle forstyrrelser, opløsningsmiddelbaseret lipidekstraktion, omestring af fedtsyrer til FAMEs, og kvantif…

Materials

Reagent and equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
tripentadecanoin (C15:0 TAG)	Sigma Aldrich	T4257	CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Larodan
Beadbeater	Bertin Technologies	Precellys 24
beadbeater tubes	MP Biomedicals	Lysing matrix E 116914500
GC-FID	Hewlett-Packer	HP6871
GC column	Supelco	Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl	Mettler Toledo	MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000	Mettler Toledo	C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml	VWR	612-1925
glass tubes	VWR	SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000	VWR	SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps	VWR	SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator	VWR	445-2101
Heated Evaporator/Concentrator	Cole-Parmer	YO-28690-25