Analyse av Fatty Acid innhold og sammensetning i Mikroalger

Summary

Fremgangsmåte for bestemmelse av fettsyreinnhold og sammensetning i mikroalger basert på mekanisk celleoppbrytning, oppløsningsmiddel basert lipid ekstraksjon, transforestring, og mengdebestemmelse og identifikasjon av fettsyrer ved hjelp av gass-kromatografi, er beskrevet. En tripentadecanoin intern standard brukes til å kompensere for de mulige tap under ekstraksjon og ufullstendig transesterifiseringen.

Abstract

En fremgangsmåte for å bestemme innholdet og sammensetningen av de totale fettsyrene som er tilstede i mikroalger er beskrevet. Fettsyrer er en viktig bestanddel av microalgal biomasse. Disse fettsyrer kan være tilstede i forskjellige acyl-lipid-klasser. Spesielt de fettsyrer som er tilstede i triacylglycerol (TAG) er av kommersiell interesse, fordi de kan brukes til fremstilling av transportbrennstoffer, bulkkjemikalier, kosttilskudd (ω-3-fettsyrer) og matvarer. For å utvikle kommersielle anvendelser, er pålitelige analysemetoder for måling av fett-syreinnhold og sammensetning nødvendig. Mikroalger er enkeltceller som er omgitt av et stivt cellevegg. En fettsyre analysemetode bør gi tilstrekkelig celleoppbrytning å frigjøre alle acyl lipider og utvinning prosedyren som brukes skal være i stand til å trekke ut alle acyl lipid klasser.

Med den fremgangsmåten som presenteres her alle fettsyrene som er tilstede i mikroalger kan være nøyaktig og reproduserbart idenserte og kvantifiseres ved hjelp av små mengder av prøven (5 mg) uavhengig av deres kjedelengde, grad av umettethet, eller lipid-klasse de er en del av.

Denne metoden gir ikke informasjon om den relative overflod av forskjellige lipidklasser, men kan bli utvidet til å skille lipidklasser fra hverandre.

Fremgangsmåten er basert på en sekvens av mekanisk celleoppbrytning, oppløsningsmiddel basert lipid ekstraksjon, transforestring av fettsyrer til fettsyremetylestere (fames), og mengdebestemmelse og identifikasjon av Slike fettsyremetylestere ved hjelp av gasskromatografi (GC-FID). En TAG intern standard (tripentadecanoin) tilsettes før prosedyren analytisk å korrigere for tap under ekstraksjon og ufullstendig transesterifiseringen.

Introduction

Fettsyrer er en av de viktigste bestanddeler av microalgal biomasse og vanligvis utgjør mellom 5 til 50% av celletørrvekt ^1-3. De er hovedsakelig tilstede i form av glycerolipids. Disse glycerolipids i sin tur består hovedsakelig av fosfolipider, glykolipider og triacylglycerol (TAG). Spesielt de fettsyrer som er tilstede i TAG er av kommersiell interesse, fordi de kan brukes som en kilde for fremstilling av transportbrennstoffer, bulkkjemikalier, kosttilskudd (ω-3-fettsyrer), samt matvarer ^3-6. Mikroalger kan vokse i sjøvann basert dyrkingsmedier, kan ha en mye høyere arealproduktivitet enn landplanter, og kan dyrkes i fotobioreaktorer på steder som ikke er egnet for jordbruk, muligens også offshore. Av disse grunner, er mikroalger ofte betraktet som et lovende alternativ til landplanter for produksjon av biodiesel og andre bulkprodukter ^3-6. Potensielt ingen landbruks log eller ferskvann (når dyrket i lukkede fotobioreaktorer og ved marine mikroalger blir brukt) som er nødvendig for deres fremstilling. Derfor er biodrivstoff avledet fra mikroalger regnet 3 ^{rd-generasjons} biodrivstoff.

Den totale cellulære innholdet av fettsyrer (% av tørrvekten), lipid-klasse sammensetning, så vel som fettsyre lengden og graden av metning er meget variabel mellom mikroalgearter. Videre har disse egenskaper varierer med dyrkningsforhold som næringsstoffer, temperatur, pH, og lysintensiteten ^1,2. For eksempel, når de utsettes for nitrogen sult, kan mikroalger akkumulerer store mengder av TAG. Under optimale vekstforhold TAG utgjør vanligvis mindre enn 2% av tørrvekt, men når de utsettes for nitrogen-utsulting TAG-innhold kan øke opp til 40% av tørrvekten microalgal ^1..

Mikroalger produserer hovedsakelig fettsyrer med kjedelengder på 16, og 18karbonatomer, men noen arter kan gjøre fettsyrer med opptil 24 karbonatomer i lengde. Både mettede så vel som høyt umettede fettsyrer blir produsert av mikroalger. Sistnevnte inkluderer fettsyrer med ernæringsmessige fordeler (ω-3 fettsyrer) som C20: 5 (eikosapentaensyre, EPA) og C22: 6 (dokosaheksaensyre, DHA) som det ikke vegetabilske alternativer eksistere ^1,2,4,7. Den (fordeling av) fettsyre kjedelengde og grad av metning bestemmer også de egenskaper og kvalitet av alger-avledet biodrivstoff og matoljer ^4,8.

For å utvikle kommersielle anvendelser av microalgal avledet fettsyrer, er pålitelige analysemetoder for kvantifisering av fettsyreinnhold og sammensetning nødvendig.

Som også påpekt av Ryckebosch et al. ^9, analyse av fettsyrer i mikroalger skiller seg fra andre underlag (f.eks vegetabilsk olje, matvarer, dyr vev ol) væreforårsake 1) mikroalger er enkeltceller omgitt av stive cellevegger, som kompliserer lipid ekstraksjon, 2) mikroalger inneholde en rekke forskjellige lipidklasser, og lipid-klasse fordelingen er svært variabel ^7.. Disse forskjellige lipidklasser har en bred variasjon i kjemisk struktur og egenskaper som polaritet. Dessuten er lipid annet enn acyl lipider klasser produsert, 3) mikroalger inneholde et bredt spekter av fettsyrer, som strekker seg 12 til 24 karbonatomer i lengde og inneholdende både mettede og umettede fettsyrer. Derfor er fremgangsmåter som er utviklet for å analysere fettsyrer andre enn mikroalger substrater, kanskje ikke er egnet til å analysere fettsyrer i mikroalger.

Som gjennomgått av Ryckebosch et al. ^9, er den viktigste forskjellen mellom vanlig brukte lipidekstraksjonen prosedyrer i løsemiddel-systemer som benyttes. På grunn av det store utvalg av lipidklasser som er tilstede i mikroalger, som hver varierer i polaritet, den ekstrahertelipid mengden vil variere med løsemidler som brukes ^10-12. Dette fører til uoverensstemmelser i lipid-innhold og sammensetning presentert i litteraturen ^9,10. Avhengig av hvilket løsningsmiddelsystem som brukes, fremgangsmåter basert på løsningsmiddelekstraksjon uten celleoppbrytning ved, for eksempel, bead vibrerende eller sonikering, ikke kan trekke ut alle lipidene på grunn av den stive konstruksjon av enkelte mikroalgearter ^9,13. I tilfelle av ufullstendig lipid ekstraksjon, kan ekstraksjonen effektiviteten av de forskjellige lipidklasser variere ^14.. Dette kan også ha en effekt på den målte fettsyresammensetning, fordi fettsyresammensetningen er variabel mellom lipidklasser ^7.

Vår fremgangsmåte er basert på en sekvens av mekanisk celleoppbrytning, oppløsningsmiddel basert lipid ekstraksjon, omestring av fettsyrer til fettsyremetylestere (fames), og kvantifisering og identifisering av Slike fettsyremetylestere ved hjelp av gasskromatografi i kombinasjon med en flamme ionizadetektor sjon (GC-FID). En intern standard i form av en triacylglycerol (tripentadecanoin) tilsettes før prosedyren analytisk. Mulige tap under ekstraksjon og ufullstendig transesterifiseringen kan da bli korrigert for. Fremgangsmåten kan brukes til å bestemme innholdet, så vel som sammensetningen av fettsyrene som er tilstede i microalgal biomasse. Alle fettsyrene som er tilstede i de forskjellige acyl-lipid klasser, herunder lagring (TAG) samt membranlipider (glykolider, fosfolipider), detekteres, identifisert og kvantifisert nøyaktig og reproduserbart ved denne metode, ved bruk av kun små mengder av prøven (5 mg) . Denne metoden gir ikke informasjon om den relative overflod av ulike lipid klasser. Imidlertid kan fremgangsmåten bli utvidet for å separere lipid-klasser av hverandre ^en. Konsentrasjonen og fettsyresammensetningen av de forskjellige lipidklasser kan deretter bestemmes individuelt.

I litteraturen flere andre metoder erbeskrevet for å analysere fett i mikroalger. Noen metoder fokuserer på totale lipofile komponenter ^15, mens andre metoder fokuserer på totale fettsyrer ^9,16. Disse alternativene omfatter gravimetrisk bestemmelse av totalt utpakkede lipider, direkte trans-forestring av fettsyrer kombinert med kvantifisering ved hjelp av kromatografi, og flekker celler med lipofile fluorescerende fargestoffer.

Et vanlig alternativ til kvantifisering av fettsyrer ved hjelp av kromatografi er kvantifisering av lipider ved hjelp av en gravimetrisk bestemmelse ^17,18. Fordeler med en gravimetrisk bestemmelse er mangel på krav til avansert og kostbart utstyr som en gasskromatograf, lette å sette opp fremgangsmåte, på grunn av tilgjengeligheten av standardiserte analyseutstyr (f.eks Soxhlet), og en gravimetrisk bestemmelse er mindre tidkrevende enn kromatografi baserte metoder. Den store fordelen med å bruke kromatografi baserte metoder på otheh hånd er at ved en slik fremgangsmåte bare fettsyrene er målt. I en gravimetrisk bestemmelse av ikke-fettsyre inneholdende lipider, som pigmenter eller steroider, er også inkludert i bestemmelsen. Disse ikke-fett-syreinneholdende lipider kan utgjøre en stor andel (> 50%) av totale lipider. Hvis man bare er interessert i fettsyreinnhold (for eksempel for biodiesel anvendelser), vil den bli overestimert når en gravimetrisk bestemmelse anvendes. I tillegg, i en gravimetrisk bestemmelse av riktigheten av analysevekt anvendes for å veie de ekstraherte lipider bestemmer prøvestørrelsen som skal benyttes. Denne mengden er vanligvis mye mer enn den mengde som trengs når kromatografi anvendes. Endelig er en annen fordel med bruk av kromatografi over gravimetrisk bestemmelse er at kromatografi gir informasjon om fettsyresammensetning.

Et annet alternativ til vår presenterte metode er direkte omestring ^16,19,20.I denne metoden lipid ekstraksjon og omestring av fettsyrer for å Slike fettsyremetylestere kombineres i ett trinn. Denne metode er raskere enn en separat ekstraksjon og omestring trinn, men ved å kombinere fremgangsmåten begrenser oppløsningsmidler som kan brukes for ekstraksjon. Dette kan negativt påvirke utvinning effektivitet. En annen fordel med et separat lipid ekstraksjon, og transforest trinn er at det gir mulighet for et ekstra lipid-klasse avstanden mellom disse trinnene ^1. Dette er ikke mulig ved direkte omestring anvendes.

Andre vanlige metoder for å bestemme fettinnholdet i mikroalger inkluderer farging biomassen med lipofile fluorescerende flekker som Nilen rød eller BODIPY og måle fluorescens signal ^21,22. En fordel ved disse metodene er at de er mindre arbeidskrevende enn alternative metoder. En ulempe med disse metodene er at den fluorescerende responsen er, av ulike grunner, variabel mellom spesies, dyrkingsforhold, lipid klasser og analytiske prosedyrer. Som et eksempel, er flere av disse variasjoner forårsaket av forskjeller i opptak av fargestoff av mikroalger. Kalibrering ved bruk av en annen kvantitativ metode er derfor nødvendig, utføres fortrinnsvis for alle de forskjellige dyrkingsbetingelser og vekststadier. Endelig, denne fremgangsmåten ikke gi informasjon om fettsyresammensetning og er mindre nøyaktig og reproduserbar enn kromatografi baserte metoder.

Den fremlagte metoden er basert på fremgangsmåten beskrevet av Lamers et al. ²³ og Santos et al. ²⁴ og har også blitt anvendt av forskjellige andre forfattere ^1,25-27. Også andre metoder er tilgjengelig som er basert på de samme prinsipper og kunne gi lignende resultater ^9,28.

Protocol

En. Prøvepreparering Det er to alternative protokoller for prøveopparbeidelse inngår som steg 1,1 og 1,2. Begge metodene er like godt egnet og gir lignende resultater, men hvis en begrenset mengde alger kulturvolum er tilgjengelig, er metoden 1.1 anbefalt. NB: For hver protokoll, forberede to ytterligere vulsten beater rør i henhold til hele protokoll, men uten tilsetning av alger for dem å bli brukt som blindprøve. På denne måten, kan toppene i kromatogram…

Representative Results

Et typisk kromatogram som oppnås via denne prosessen er vist i figur 1. Slike fettsyremetylestere separeres etter størrelse og graden av metning av GC-kolonnen, og protokollen som brukes. Kortere kjedelengde fettsyrer og mer mettede fettsyrer (færre doble obligasjoner) har kortere oppholdstid. Den brukte GC kolonne og protokoll ikke har tenkt å skille fettsyre isomerer (samme kjedelengde og grad av metning, men forskjellige posisjoner av dobbeltbindinger), men dette kan oppnås ved å bruke en annen…

Discussion

Den beskrevne fremgangsmåte kan brukes til å bestemme innholdet, så vel som sammensetningen av de totale fettsyrene som er tilstede i microalgal biomasse. Fettsyrer avledet fra alle lipidklasser, herunder lagring (TAG) samt membranlipider (fosfolipider og glykolider), blir detektert. Alle fettsyre-kjedelengder og grader av metning som er tilstede i mikroalger kan påvises og skilles. Fremgangsmåten er basert på mekanisk celleoppbrytning, oppløsningsmiddel basert lipid ekstraksjon, omestring av fettsyrer til Slike …

Materials

Reagent and equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
tripentadecanoin (C15:0 TAG)	Sigma Aldrich	T4257	CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Larodan
Beadbeater	Bertin Technologies	Precellys 24
beadbeater tubes	MP Biomedicals	Lysing matrix E 116914500
GC-FID	Hewlett-Packer	HP6871
GC column	Supelco	Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl	Mettler Toledo	MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000	Mettler Toledo	C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml	VWR	612-1925
glass tubes	VWR	SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000	VWR	SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps	VWR	SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator	VWR	445-2101
Heated Evaporator/Concentrator	Cole-Parmer	YO-28690-25