Ratiometrisk Biosensors som måler Mitokondrie Redox stat og ATP i levende gjærceller

Summary

Vi beskriver bruk av to Ratiometrisk, genetisk kodet biosensorer, som er basert på GFP, til å overvåke mitokondrielle redokstilstand og ATP-nivåer på subcellular oppløsning i levende gjærceller.

Abstract

Mitokondriene har roller i mange cellulære prosesser, fra energiomsetningen og kalsiumhomeostase til kontroll av mobilnettet levetid og programmert celledød. Disse prosessene påvirker og påvirkes av redoks status og ATP produksjonen av mitokondriene. Her beskriver vi bruk av to Ratiometrisk, genetisk kodet biosensorer som kan oppdage mitokondrie redokstilstand og ATP-nivåer på subcellular oppløsning i levende gjærceller. Mitokondrielle redokstilstand måles ved hjelp av redoks-sensitive grønt fluorescerende protein (roGFP) som er målrettet mot den mitokondriematrix. Mito-roGFP inneholder cysteiner i posisjonene 147 og 204 av GFP, som er gjenstand for reversibel og miljø-avhengig oksidasjon og reduksjon, som i sin tur endrer eksitasjon spektrum av proteinet. MitGO-ATeam er en Förster resonans energi overføring (FRET) probe der ε subenhet av F _o F _1-ATP syntase er klemt mellom FRET donor og acceptor fluorescent proteiner. Binding av ATP til ε subenheten resultater i konfirmasjoner endringer i protein som bringer FRET donor og akseptor i umiddelbar nærhet og gir mulighet for fluorescens resonans energi overføring fra giver til acceptor.

Introduction

Mitokondrier er viktige organeller for ATP produksjon, biosyntesen av aminosyrer, fettsyrer, heme, jern svovel klynger og pyrimidiner. Mitokondriene spiller også sentrale roller i kalsiumhomeostase, og i regulering av apoptose. ^En økende bevis linker mitokondrier til aldring og aldersrelaterte sykdommer som Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, og Huntingtons sykdom. ² Mens individer lever hele sitt liv med mutasjoner i mitokondrie proteiner som er assosiert med nevrodegenerative sykdommer, sykdomssymptomer forekommer først senere i livet. Dette indikerer at endringer skjer i mitokondriene med alderen som gjør at sykdommen patologi å dukke opp. Faktisk er mitokondrie fitness korrelert med generell celle helse og levetid i gjær og mammalske celler. ^3,4 Her beskriver vi hvordan du bruker genetisk kodet, Ratiometrisk fluorescerende biosensorer for å vurdere to kritiske funksjoner i mitochondria i levende gjærceller: redokstilstand og ATP nivåer.

Mitokondriefunksjon i aerobic energi mobilisering er godt etablert. Mitokondrielle redokstilstand er et produkt av å redusere og oksiderende arter i organeller, inkludert NAD ⁺ / NADH, FAD / FADH _2, NADP ⁺ / NADPH, glutation / glutation disulfide (GSH / GSSG) og reaktive oksygen arter (ROS). Uncoupling mitokondrier eller hypoksi påvirker mitokondrielle luftveiene aktivitet og endrer forholdet mellom NAD ⁺ til NADH i organeller. ROS, som er produsert fra ineffektiv elektron overføring mellom komplekser av elektrontransportkjeden i den indre mitokondrie-membran, så vel som fra deaminering av aminer via monoaminoksidase i den ytre mitokondriemembranen ^5, skade lipider, proteiner og nukleinsyrer, og har vært knyttet til aldring og alder-assosiert nevrodegenerative sykdommer ^6,7,8. ROS også spille en rolle i signaloverføringen i mitochondria, gjennom oksidasjon av GSH. For eksempel NADH dehydrogenase ikke bare bidrar til ROS produksjon, men også er regulert gjennom interaksjoner med glutation pool ^9,10. α-ketoglutarat dehydrogenase og aconitase, komponenter av TCA-syklus, utviser redusert aktivitet i oksiderende omgivelser ^11,12.

Faktisk er redoks-avhengige reguleringen av aconitase aktivitet bevart fra bakterier til pattedyr ^13,14. Dermed overvåke redokstilstand og ATP nivåer av mitokondrier er avgjørende for å forstå deres funksjon og rolle i patologi.

Biokjemiske metoder har blitt brukt til å vurdere redokstilstand eller ATP nivåer av hele celler eller isolerte mitokondrier. Brukte metodene for å vurdere redokstilstand av hele celler eller isolerte mitokondrier er basert på å måle nivåene av redoks par GSH / GSSG ^15. Den luciferin-luciferase system er vanlig å måle mitokondrielleATP-nivåer i enten permeabilized hele celler eller isolerte mitokondrier. ^{16,17,18,19,20} i denne analysen, bindes til ATP og luciferase katalyserer oksydasjonen av luciferin og kjemiluminescens fra. ^21. Intensiteten av det utsendte lys er proporsjonal med mengden av ATP i reak-sjonsblandingen. ^22.

Disse fremgangsmåter har vist fundamental informasjon vedrørende mitokondriell funksjon, inkludert det funn at pasienter med nevrodegenerative sykdommer, så som Alzheimers sykdom, er unormalt lave ATP-nivåer. ^23. De kan imidlertid ikke brukes til bilde levende, intakte celler. Videre metoder basert på hel-celle-analyse gir et gjennomsnitt på redoks-tilstanden eller ATP-nivåer i alle kamrene i cellen. Målinger i isolerte organeller er potensielt problematisk fordi mitokondrie redokstilstand eller ATP-nivåer kan endres i løpet subcellular fraksjonering. Til slutt, nyere studier fra vårt laboratorium og andre tyder på atmitokondriene i individuelle celler er heterogene i funksjon, som i sin tur påvirker levetiden for mor og datter celler. ^3. Dermed er det behov for å måle mitokondrie ATP nivåer og redokstilstand i levende celler med subcellular oppløsning.

De biosensorer for mitokondriefunksjonen beskrevet her er begge basert på GFP. Redox-sensitive GFP (roGFP) ^24,25 er en GFP variant der overflate-utsatte cysteiner legges til molekylet. roGFP, som vill-type GFP, har to eksitasjon toppene (på ~ 400 nm og ~ 480 nm) og ett utslipp topp på ~ 510 nm. Oksydasjon av cysteinrester i roGFP resulterer i en økning i eksitasjon ved ~ 400 nm. Reduksjon av disse cysteinene favoriserer eksitasjon ved ~ 480 nm. Således, avslører forholdet 510 nm emisjon ved eksitering av roGFP ved 480 nm og 400 nm den relative mengde av redusert og oksidert roGFP, som reflekterer redokstilstand av fluoroforen miljø.

To versioner av roGFP er utbredt: roGFP1 og roGFP2. Begge inneholder de samme cystein innsettinger. roGFP1 er basert på vill-type GFP og roGFP2 er basert på S65T GFP, som har mer effektiv eksitasjon ved 480 nm og mindre effektiv eksitasjon ved 400 nm i forhold til wtGFP ^24. roGFP1 er mindre pH sensitiv enn roGFP2 og dens dynamiske området strekker seg videre inn i redusert rekkevidde. Således kan roGFP1 være mer nyttig for å overvåke mer reduserende avdelinger som mitokondrier eller i cytosol, og rom med variabel pH, slik som endosomer. roGFP2 tilbyr lysere signal, og i noen studier, en større dynamisk omfang enn roGFP1 ^24,26. Studier hos Arabidopsis thaliana indikerer at den tid som kreves for respons på endringer i redokstilstand er lik for begge sensorer (halveringstiden for oksidasjon, 65 og 95 sek og halveringstiden for reduksjon, 272 og 206 sek, for roGFP1 og roGFP2, henholdsvis). ^26.

MitGO-ATeam2 er en minimal invasiv, påliteligsensor som måler mitokondrie ATP i den spirende gjær Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam er en Förster resonans energioverføring (FRET) probe som består av ε subenhet av K _o K _1-ATP syntase klemt mellom FRET donor og akseptor fluorescerende protein (GFP og appelsin fluorescerende protein (OFP), henholdsvis). ^27. Binding av ATP til ε subenheten resulterer i konformasjonsendringer i proteinet som bringer FRET donor i umiddelbar nærhet til akseptor og gi rom for energioverføring fra donor til akseptor. Det finnes to varianter av GO-ATeam, GO-ATeam1 og GO-ATeam2. GO-ATeam2 har en høyere affinitet for MgATP enn GO-ATeam1, noe som gjør den mer egnet for å måle vanligvis lavere [ATP] i mitokondriene i forhold til cytosol. ^27.

Å sondere mitokondrie redokstilstand, bygget vi en fusjon protein (mito-roGFP1) bestående av roGFP1 smeltet til ATP9 ledersekvensen ennd uttrykt fra en centromer-basert (lav kopi nummer) gjær ekspresjonsplasmid under kontroll av den sterke glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (BNP) promoter (p416GPD, Addgene). Vi brukte roGFP1 å sondere redox status av mitokondrier i sammenheng med aldring av modellen sopp Saccharomyces cerevisiae. Vi finner at roGFP1 kan detektere endringer i mitokondriell redokstilstand som opptrer under aldring og som svar på næringsstoffer, men har ingen tydelig skadelig virkning på gjærcellene. Vi ser også variasjon i redokstilstand av mitokondriene i individuelle levende gjærceller, et funn som understreker viktigheten av en biosensor med subcellular romlig oppløsning.

MitGO-ATeam2 er en variant av GO-ATeam2, som har mitokondrie signal sekvens av cytokrom c oksidase subenheten VIIIA satt inn i aminoenden av GO-ATeam2. ^27. Vi endret mitGO-ATeam2 probe (vennlig levert av laboratoriet av H. Noji, Institutt of Scientific and Industrial Research, Osaka University, Japan) for bruk i gjær ved subkloning det, via Xba1 og HindIII områder, inn i gjær ekspresjonsvektoren pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, USA), som er en lav-kopi plasmid inneholder sterke konstituerende GPD promoter. Vi uttrykte mitGO-ATeam2 i spirende gjær, og finne, ved kontrafarging med den DNA-bindende fargestoff DAPI, at den lokaliserer utelukkende til mitokondriene, hvor det tjener som en effektiv sonde for å måle fysiologiske forandringer i mitokondrie ATP-nivåer.

roGFP og GO-ATeam er både genetisk kodet. Som et resultat, kan de innføres og opprettholdes stabilt i intakte celler, og gir informasjon om redokstilstand eller ATP-nivåer i individuelle, levende celler. Dessuten, begge biosensorer overvåke endringer i redokstilstand eller ATP nivåer som oppstår under fysiologiske forhold. ^28. Begge sondene er også proporsjonal. Som et resultat, er målinger gjort med disse probene ikke påvirket av changes i biosensor konsentrasjon eller prøve belysning eller tykkelse. Til slutt, begge biosensorer gi subcellular romlig oppløsning. Faktisk har roGFP blitt rettet mot mitokondrier, ER, endosomes og peroxisomes ^24, og kan oppdage endringer i redokstilstand av hver av disse organeller, stort sett uavhengig av pH.

Protocol

En. Transformasjon av gjærceller med Biosensors Transformere den ønskede gjærstamme med plasmid peiling mito-roGFP eller mitGO-ATeam2 bruker litium acetat metode 27. For å bekrefte transformasjon med plasmidet-borne biosensor og for å hindre tap av plasmidet ved å velge og opprettholde transformanter på passende selektiv syntetisk komplett medium (SC-ura for mito-roGFP, eller SC-Leu for mitGo-ATeam2). Hvis den fluorescerende probe er blitt subklonet i et annet plasmid som ikke er b…

Representative Results

Måling mitokondrie redokstilstand med mito-roGFP Her viser vi at mito-roGFP1 har det dynamiske området til å oppdage endringer i mitokondrie redokstilstand fra fullt oksidert til redusert i levende gjærceller, uten at det påvirker gjær cellevekst eller mitokondrie morfologi. Først finner vi vokser celler uttrykker mitokondrier-målrettet GFP og roGFP1 ved normale priser (figur 1A). Den maksimale veksten, målt ved maksimal helling på vekstkurven i log-fase vekst og tide…

Discussion

Her beskriver vi metoder for å bruke mito-roGFP1 og mitGO-ATeam2 som biosensorer for å vurdere mitokondrie redokstilstand og ATP nivåer i levende gjærceller. Vi finner at uttrykket av plasmid-borne mito-roGFP1 eller mitGO-ATeam resulterer i kvantitative målretting til mitokondriene, uten noen åpenbar effekt på mitokondrie morfologi eller distribusjon eller på mobilnettet vekstrater. ³ Mito-roGFP1 kan oppdage endringer i mitokondrie redokstilstand fra høyt oksidert til sterkt reduserte stater. Likeled…

Materials

			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18×18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/