Quantification temporelle d'expression MAPK induite en simples cellules de levure
Summary
Deux méthodes complémentaires basées sur la cytométrie en flux et la microscopie sont présentées qui permettent la quantification, au niveau de la cellule unique, de la dynamique de l'expression génique induits par l'activation d'une voie de MAPK dans la levure.
Abstract
La quantification de l'expression des gènes au niveau d'une seule cellule découvre les mécanismes de régulation nouveaux occultés dans les mesures effectuées au niveau de la population. Deux méthodes basées sur la microscopie et cytométrie en flux sont présentés pour démontrer comment ces données peuvent être acquises. L'expression d'un rapporteur fluorescent induit lors de l'activation de la voie MAPK glycérol haute osmolarité dans la levure est utilisé comme un exemple. Les avantages spécifiques de chacune de ces méthodes sont mises en évidence. Cytométrie de flux mesure un grand nombre de cellules (10 000) et fournit une mesure directe de la dynamique de l'expression protéique indépendante de la cinétique de maturation lente de la protéine fluorescente. Imagerie des cellules vivantes par microscopie est en revanche limitée à la mesure de la forme mature de la journaliste dans moins de cellules. Cependant, les ensembles de données générées par cette technique peuvent être extrêmement riches grâce à la combinaison de plusieurs journalistes et à l'information spatiale et temporelleobtenu à partir de cellules individuelles. La combinaison de ces deux méthodes de mesure peut offrir de nouvelles perspectives sur la régulation de l'expression de la protéine par des voies de signalisation.
Introduction
La signalisation par l'intermédiaire de cascades de transduction aboutit souvent à l'expression de protéines. La caractérisation de ce profil d'expression est un élément clé dans la compréhension de la fonction des voies biologiques. L'identification du spectre de régulés à la hausse des protéines et la dynamique de leur activation peut être réalisée par diverses techniques telles que les micro-réseaux, des taches ou des taches Nord Ouest 1-3. Cependant, ces moyens techniques de la réponse d'une population entière de cellules. Pour comprendre la régulation fine de l'expression des protéines, il est souhaitable de recueillir des mesures au niveau de la cellule unique. Idéalement, ces mesures devraient également fournir des données quantitatives se prêtent à développer des modèles mathématiques de la voie sous-jacent.
Microscopie et cytométrie en flux deux techniques, qui sont idéalement adaptés à la diffusion de telles mesures quantitatives de cellules individuelles. Le marquage endogène des protéines avec une protéine fluorescente peut be utilisé pour quantifier le niveau d'expression de 4. Cependant, étant donné que l'addition d'un grand fragment fluorescent à l'extrémité de la protéine peut rendre non fonctionnel, il est souvent plus souhaitable de générer reporters d'expression spécifiques basés sur un promoteur commandant l'expression d'une construction fluorescent. Cette protéine rapporteur est exogène au système cellulaire et donc n'influence pas les événements de signalisation qui se déroulent dans la cellule.
À la fois la microscopie et la cytométrie en flux ont été largement utilisés dans le domaine de signalisation de la levure. A titre d'exemples, Colman-Lerner et collègues corrélés, dans des cellules individuelles, l'expression de l'accouplement journalistes spécifiques et exprimées de manière constitutive par microscopie à quantifier le bruit dans la levure accouplement transduction du signal cascade 5, Acar et ses collègues ont utilisé la cytométrie en flux pour étudier le réseau de régulation contrôler l'expression des gènes GAL 6. Dans une étude précédente 7, nous avons utilisé un combinatisur ces deux techniques pour étudier la sortie de l'expression de l'osmolarité glycérol élevé (HOG) de la voie dans la levure bourgeonnante. Cette mitogen activated protein kinase (MAPK) est déclenchée par le stress hyper-osmotique. Elle se traduit par l'activation des MAPK Hog1, qui subit une translocation vers le noyau de la cellule pour induire la transcription d'un programme résultant dans l'expression d'approximativement 300 gènes. Pour étudier ce processus, nous avions conçu un journaliste d'expression basé sur le promoteur de STL1 (un gène induit spécifiquement en réponse à l'activité de Hog1 8) entraînant l'expression d'une protéine fluorescente Vénus quadruple (p STL1-qV). La cytométrie en flux des mesures ont découvert la présence de deux populations de cellules au niveau de la tension intermédiaire (0,1 M de NaCl) avec seulement une fraction de la population exprimant le rapporteur fluorescent. Nous avons utilisé la microscopie à approfondir ce comportement et découvert que ce bruit dans l'expression de la protéine a été régie par des facteurs intrinsèques 9. Nous Could en outre observer que les cellules avec un niveau d'activité similaire Hog1 pourraient afficher de façon saisissante différents résultats d'expression. La combinaison de ces deux techniques nous a permis de montrer comment le remodelage lent des gènes de réponse au stress influencé le résultat de l'expression au niveau d'une seule cellule 7.
Dans cet article, nous utilisons l'expression de la p-qV STL1 journaliste induite par le choc hyper-osmotique, par exemple, de la quantification de l'expression des protéines par microscopie et cytométrie de flux. La même souche soumis à NaCl 0,2 M de stress a été étudiée avec les deux techniques. Cela nous permettra de mettre en évidence certaines différences clés dans ces deux techniques très complémentaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microscopie
Le traitement des puits avec de la ConA est une étape essentielle pour assurer une imagerie appropriée des cellules. Parce que la ConA a une faible solubilité dans du PBS (5 mg / ml), le procédé de filtration permet l'élimination des gros agrégats qui sont présents dans la solution filtrée et interfèrent avec la formation d'image. Les cellules se fixent relativement fortement à la surface traitée et l'addition de la solution ne doit pas perturber l'induct…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Matthias Peter et son groupe à l'Institut de biochimie à l'EPF de Zürich où ces méthodes ont été développées. Ce travail a été soutenu par le Fonds national suisse de la science.
Materials
| Reagent | |||
| Yeast Nitrogen Base | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM amino-acid mix | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxic |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) – quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Microscope control software | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| Incubation chamber | LIS | The Box | |
| Fluorescence light source | Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Flow cytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator bath | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-well-slide | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-well-plate | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS tube | BD Falcon | 352054 |
References
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