La quantificazione temporale di espressione MAPK indotta in cellule di lievito singole
Summary
Due metodi complementari basati sulla citometria di flusso e microscopia sono presentati che consentono la quantificazione, a livello di singola cellula, delle dinamiche di espressione genica indotte dall'attivazione di una via MAPK in lievito.
Abstract
La quantificazione dell'espressione genica a livello di singola cellula svela nuovi meccanismi di regolamentazione oscurate nelle misurazioni effettuate a livello di popolazione. Due metodi basati sulla microscopia e citometria a flusso sono presentati per illustrare come tali dati possono essere acquisiti. L'espressione di un reporter fluorescente indotto all'attivazione della elevata osmolarità glicerolo MAPK in lievito è usato come esempio. I vantaggi specifici di ciascun metodo sono evidenziati. Flusso misura citometria un gran numero di cellule (10.000) e fornisce una misura diretta delle dinamiche di espressione proteica indipendente delle lenti cinetica di maturazione della proteina fluorescente. Imaging di cellule viventi mediante microscopia è invece limitato alla misura della forma maturato del reporter in meno cellule. Tuttavia, le serie di dati generati da questa tecnica possono essere estremamente ricco grazie alle combinazioni di reporter multipli e alle informazioni spaziale e temporaleottenuto da cellule singole. La combinazione di questi due metodi di misurazione in grado di fornire nuove intuizioni sulla regolazione dell'espressione proteica mediante vie di segnalazione.
Introduction
Segnalazione via cascate di trasduzione spesso culmina nella espressione di proteine. La caratterizzazione di questo profilo di espressione è un elemento chiave per comprendere la funzione di percorsi biologici. L'identificazione dello spettro di up-regolata proteine e le dinamiche della loro attivazione può essere ottenuto attraverso diverse tecniche come micro-array, Northern blot o western blot 1-3. Tuttavia, queste tecniche media la risposta di un'intera popolazione di cellule. Per comprendere la regolazione fine della espressione delle proteine, è desiderabile raccogliere misurazioni a livello di singola cellula. Idealmente, queste misure dovrebbero anche fornire dati quantitativi suscettibili di sviluppare modelli matematici della via sottostante.
Microscopia e citometria a flusso sono due tecniche, che sono ideali per fornire tali misurazioni quantitative singola cellula. La codifica endogena di proteine con una proteina fluorescente può be utilizzato per quantificare il loro livello di espressione 4. Tuttavia, dato che l'aggiunta di una grande porzione fluorescente al terminale della proteina può renderlo non funzionale, è spesso più desiderabile generare specifici reporter di espressione basati su un promotore guida l'espressione di un costrutto fluorescente. Questa proteina giornalista è esogeno al sistema cellulare e quindi non influenza gli eventi di segnalazione che stanno avvenendo nella cella.
Sia microscopia e citometria a flusso sono stati ampiamente utilizzati in campo segnalamento lievito. Come esempi; collaboratori Colman-Lerner e correlati, in singole cellule, l'espressione di accoppiamento reporter specifici e costitutivamente espresse mediante microscopia a quantificare il rumore nel lievito accoppiamento trasduzione del segnale cascata 5, Acar e colleghi flusso citometria utilizzati per studiare la rete di regolamentazione controllo dell'espressione dei geni GAL 6. In uno studio precedente 7, abbiamo utilizzato una combinatisu queste due tecniche per studiare l'espressione uscita dal glicerolo alta osmolarità (HOG) percorso in erba lievito. Questo mitogen proteina chinasi attivata (MAPK) è innescato da stress iper-osmotico. Esso determina l'attivazione dei Hog1 MAPK, che trasloca nel nucleo della cellula per indurre un programma trascrizionale conseguente espressione di circa 300 geni. Per studiare questo processo, abbiamo costruito un reporter espressione basato sul promotore STL1 (un gene indotto specificamente in risposta all'attività Hog1 8) che guida l'espressione di una proteina fluorescente Venus quadrupla (p STL1-qv). Citofluorimetria misurazioni scoperto la presenza di due popolazioni di cellule a livello di stress intermedio (0.1 M NaCl) con solo una frazione della popolazione che esprime il reporter fluorescente. Abbiamo usato la microscopia di approfondire questo comportamento e abbiamo scoperto che questo rumore di espressione della proteina è stata governata da fattori intrinseci 9. Noi could osservano inoltre che le cellule con un analogo livello di attività Hog1 possono visualizzare profondamente diversi esiti di espressione. La combinazione di queste due tecniche ha permesso di dimostrare come la lenta ristrutturazione dei geni di risposta allo stress ha influenzato l'esito espressione a livello di singola cellula 7.
In questo lavoro, usiamo l'espressione della p STL1-qV giornalista indotta dallo shock iper-osmotico come un esempio della quantificazione dell'espressione proteica mediante microscopia e citometria a flusso. Lo stesso ceppo sottoposto a 0,2 M NaCl sforzo è stato studiato con entrambe le tecniche. Questo ci permetterà di evidenziare alcune differenze fondamentali in queste due tecniche altamente complementari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microscopia
Il trattamento del pozzetto con ConA è un passo essenziale per assicurare una corretta rappresentazione delle cellule. Poiché ConA ha una bassa solubilità in PBS (5 mg / ml), il processo di filtrazione permette la rimozione di grandi aggregati che sono presenti nella soluzione filtrata e interferiscono con l'imaging. Cellule attribuiscono relativamente fortemente alla superficie trattata e l'aggiunta della soluzione indurre non dovrebbero disturbare la localizzazione dell…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Matthias Peter e il suo gruppo presso l'Istituto di Biochimica presso l'ETH di Zurigo, dove sono stati sviluppati questi metodi. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation svizzero.
Materials
| Reagent | |||
| Yeast Nitrogen Base | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM amino-acid mix | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxic |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) – quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Microscope control software | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| Incubation chamber | LIS | The Box | |
| Fluorescence light source | Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Flow cytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator bath | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-well-slide | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-well-plate | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS tube | BD Falcon | 352054 |
References
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