Temporal Kvantifisering av MAPK Induced Expression i Enkeltgjærceller
Summary
To komplementære fremgangsmåter basert på strømningscytometri og mikros presenteres som muliggjør kvantifiseringen, på celle-nivået, av dynamikken i genekspresjon indusert ved aktivering av en MAPK veien i gjær.
Abstract
Kvantifisering av genuttrykk på celle-nivå avdekker nye reguleringsmekanismer skjult i målinger utført på befolkningsnivå. To metoder basert på mikroskopi og flowcytometri presenteres for å demonstrere hvordan slike data kan bli kjøpt opp. Ekspresjonen av et fluorescerende reporter indusert ved aktivering av den høye osmolaritet glycerol MAPK veien i gjær blir brukt som eksempel. De spesifikke fordeler ved hver metode er uthevet. Strømningscytometri måler et stort antall av celler (10 000), og gir et direkte mål på dynamikken i proteinekspresjon uavhengig av den langsomme kinetikk modning av det fluorescerende protein. Avbilding av levende celler ved mikroskopi er derimot begrenset til målingen av den modne form av reporteren i færre celler. Imidlertid kan de datasettene som genereres av denne teknikken være ekstremt rike takket være kombinasjoner av flere journalister og til romlig og tidsmessig informasjonoppnådd fra individuelle celler. Kombinasjonen av disse to målemetoder kan levere nye innsikter om regulering av protein uttrykk ved signalveier.
Introduction
Signalering via transduksjon kaskader ofte kulminerer i uttrykket av proteiner. Karakteriseringen av dette uttrykket profilen er et nøkkelelement for å forstå funksjonen av biologiske mekanismer. Identifiseringen av spekteret av oppregulert proteiner og dynamikken i aktivering kan oppnås ved forskjellige teknikker slik som mikro-matriser, nord blots eller western blots 1-3. Imidlertid er disse teknikker gjennomsnittet responsen fra hele populasjonen av celler. For å forstå den fine regulering av ekspresjonen av proteinene, er det ønskelig å samle inn målinger på celle-nivået. Ideelt sett bør disse målingene også gi kvantitative data mottagelig for å utvikle matematiske modeller av den underliggende bane.
Mikroskopi og flowcytometri er to teknikker, som er ideell for å levere slike kvantitative encellete målinger. Den endogene merking av proteiner med et fluorescent protein kan be brukes til å kvantifisere deres uttrykk nivå fire. Imidlertid, siden tilsetningen av et stort fluorescerende rest ved terminus av proteinet kan gjengi det ikke-funksjonelt, er det ofte mer ønskelig å generere spesifikke ekspresjonssystemer reportere basert på en promoter som driver ekspresjonen av et fluoriserende konstruksjon. Denne rapportørprotein er eksogen til mobilsystemet, og derfor ikke påvirker signale hendelser som finner sted i cellen.
Både mikroskopi og flowcytometri har blitt mye brukt i gjærsignalfeltet. Som eksempler; Colman-Lerner og kolleger korrelert, i enkeltceller, uttrykk for parring spesifikke og konstitutivt uttrykt reportere ved mikroskopi for å kvantifisere støy i gjær parring signaltransduksjon cascade 5, Acar og kolleger brukte flowcytometri å studere regulatoriske nettverk kontrollere uttrykket av GAL gener seks. I en tidligere studie 7, har vi brukt en Oppkjøpon av disse to teknikker for å studere ekspresjonen utgangen fra høy osmolaritet glycerol (HOG) pathway in spirende gjær. Dette mitogen aktivert protein kinase (MAPK) veien er utløst av hyper-osmotisk stress. Det resulterer i aktivering av MAPK Hog1, som translocates til kjernen av cellen for å indusere en transkripsjonen program som resulterer i ekspresjonen av omtrent 300 gener. For å undersøke denne prosessen hadde konstruerte et uttrykk reporter basert på STL1 promoter (et gen induseres spesifikt i respons til Hog1 aktivitet 8) som driver ekspresjonen av en firedoble Venus fluorescerende protein (p STL1-qV). Strømningscytometri målinger avdekket nærværet av to populasjoner av celler på mellomspenningsnivå (0,1 M NaCl) med bare en del av befolkningen som uttrykker det fluorescerende reporter. Vi brukte mikroskop for å videre undersøke dette problemet og oppdaget at denne støyen i protein uttrykk ble styrt av indre faktorer ni. Vi COUld observere videre at celler med et tilsvarende nivå av Hog1 aktivitet kunne vise påfallende forskjellige uttrykk utfall. Kombinasjonen av disse to teknikkene tillatt oss å demonstrere hvordan den langsomme ombygging av stress respons gener påvirket uttrykket utfallet på celle-nivå syv.
I denne artikkelen bruker vi uttrykket av p STL1-qV reporter indusert av hyper-osmotisk sjokk som et eksempel på kvantifisering av protein uttrykk ved mikroskopi og flowcytometri. Samme stamme utsatt til 0,2 M NaCl stresset ble studert med begge teknikkene. Dette vil gi oss mulighet til å fremheve noen viktige forskjeller i disse to svært komplementære teknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikros
Behandling av brønnen med ConA er et viktig skritt for å sikre en riktig avbildning av cellene. Fordi ConA har lav oppløselighet i PBS (5 mg / ml), kan filtrerings-prosess for fjerning av store aggregater som er tilstede i den ufiltrerte løsning og forstyrre avbildning. Cellene fester relativt sterkt til den behandlede overflate, og tilsetningen av det induserende oppløsningen bør ikke forstyrre lokalisering av cellene, slik at for en kontinuerlig sporing før og etter stimuleringe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Matthias Peter og hans gruppe ved Institutt for biokjemi ved ETH i Zürich hvor disse metodene har blitt utviklet. Dette arbeidet har vært støttet av den sveitsiske National Science Foundation.
Materials
| Reagent | |||
| Yeast Nitrogen Base | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM amino-acid mix | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxic |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) – quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Microscope control software | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| Incubation chamber | LIS | The Box | |
| Fluorescence light source | Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Flow cytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator bath | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-well-slide | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-well-plate | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS tube | BD Falcon | 352054 |
References
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
- de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes. Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Wu, J. -. Q., Pollard, T. D. Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast. Science. 310 (5746), 310-314 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions. Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).
- Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression. Science. 332 (6030), 732-735 (2011).
- de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
- Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome biology. 7 (10), R100 (2006).
- Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).
- Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images. Current protocols in molecular biology. , (2012).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).
- Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).
