A quantificação temporal da expressão MAPK induzida em células de levedura Solteiro

Summary

Dois métodos complementares baseados em citometria de fluxo e microscopia são apresentadas, que permitem a quantificação, no nível de uma única célula, da dinâmica da expressão de genes induzidos pela activação de uma via de MAPK em levedura.

Abstract

A quantificação da expressão gênica no nível da célula única descobre novos mecanismos de regulação obscurecidos em medições realizadas a nível da população. Dois métodos baseados em citometria de fluxo e microscopia são apresentados para demonstrar a forma como esses dados podem ser adquiridos. A expressão de um repórter fluorescente induzida após a activação da MAPK alta osmolaridade glicerol via em levedura é usada como um exemplo. As vantagens específicas de cada método são realçados. A citometria de fluxo mede um grande número de células (10.000) e proporciona uma medida direta da dinâmica da expressão proteica independente da cinética de maturação lenta da proteína fluorescente. Imagiologia de células vivas por microscopia por contraste é limitada para a medição da forma amadurecida do repórter no menor número de células. No entanto, os conjuntos de dados gerados por esta técnica pode ser extremamente ricos graças às combinações de vários jornalistas e à informação espacial e temporalobtido a partir de células individuais. A combinação destes dois métodos de medição pode oferecer novos insights sobre a regulação da expressão de proteínas por vias de sinalização.

Introduction

A sinalização por meio de cascatas de transdução de muitas vezes termina com a expressão de proteínas. A caracterização desse perfil de expressão é um elemento chave para a compreensão da função das vias biológicas. A identificação do espectro de sobre-regulada de proteínas e sua dinâmica de activação pode ser alcançada por diversas técnicas, tais como as micro-matrizes, transferências de Northern ou Western blot ^1-3. No entanto, essas técnicas de média a resposta de uma população inteira de células. Para compreender a regulação fina da expressão de proteínas, é desejável reunir as medições ao nível da célula individual. O ideal é que estas medidas também deve fornecer dados quantitativos passíveis de desenvolver modelos matemáticos da via subjacente.

Microscopia e citometria de fluxo são duas técnicas, as quais são idealmente adequados para entregar tais medições quantitativas de uma única célula. A marcação de proteínas endógeno com uma proteína fluorescente pode be utilizada para quantificar o nível de expressão ^4. No entanto, uma vez que a adição de uma grande porção fluorescente no terminal da proteína pode torná-la não-funcional, isto é, muitas vezes mais desejável gerar repórteres de expressão específicas com base em um promotor dirigindo a expressão de uma construção fluorescente. Esta proteína repórter é exógeno ao sistema celular e, portanto, não influencia os eventos de sinalização que estão ocorrendo na célula.

Ambos microscopia e citometria de fluxo têm sido amplamente utilizados no campo de sinalização de levedura. Como exemplos; Colman-Lerner e colaboradores correlacionados, em células individuais, a expressão de acasalamento repórteres específicos e constitutivamente expressos por microscopia para quantificar o ruído em levedura acasalamento cascata de transdução de sinal ^5, Acar e colegas utilizados citometria de fluxo para estudar a rede reguladora controlando a expressão dos genes GAL ^6. Em um estudo anterior ^7, nós usamos uma associaçem uma dessas duas técnicas para estudar a saída expressão do alto glicerol osmolaridade (HOG) via em brotamento da levedura. Este mitógeno proteína quinase ativada (MAPK) é desencadeada por estresse hiper-osmótico. Isso resulta na activação dos Hog1 MAPK, que transloca-se para o núcleo da célula para induzir um programa transcricional resultando na expressão de cerca de 300 genes. Para estudar este processo, que tinha engenharia um repórter com base na expressão do promotor STL1 (um gene induzido especificamente em resposta à actividade Hog1 ⁸⁾ dirigindo a expressão de uma proteína fluorescente Vénus quádruplo (p STL1-qV). A citometria de fluxo medições revelaram a presença de duas populações de células no nível de tensão intermédia (NaCl 0,1 M), com apenas uma fracção da população que expressa o repórter fluorescente. Nós usamos a microscopia para investigar mais este comportamento e descobriu que este ruído na expressão da proteína foi governada por fatores intrínsecos ^9. Nós could observar, ainda, que as células com um nível semelhante de atividade Hog1 poderia exibir resultados muito diferentes de expressão. A combinação destas duas técnicas permitiram-nos demonstrar como a remodelação lenta dos genes de resposta ao stress influenciou a expressão resultados ao nível da célula individual ^7.

Neste trabalho, usamos a expressão da p STL1-qV repórter induzida pelo choque hiper-osmótico como um exemplo da quantificação da expressão da proteína por microscopia e citometria de fluxo. A mesma cepa submetidos a 0,2 M NaCl estresse foi estudado com ambas as técnicas. Isto irá permitir-nos para destacar algumas das principais diferenças nestas duas técnicas altamente complementares.

Protocol

1. Medidas Microscopia Inocular 5 ml de meio sintético com levedura. Crescer as células a 30 ° C durante a noite. Medir a OD 600 da cultura durante a noite a na manhã seguinte. Dilui-se a cultura durante a noite em 5 ml de meio sintético de OD 600 de 0,05. Crescer a cultura diluída a 30 ° C durante pelo menos 4 horas. Preparar 3 vezes concentrado (0,6 M) de NaCl em meio sintético. Prepara-se uma solução de 1 mg / ml de…

Representative Results

Microscopia As células de levedura que ostentam a expressão repórter p-STL1 qV (ySP9 7) foram ligados ao fundo do poço de deslizamento e colocado sob o microscópio. As células foram estimuladas pela adição de meio de pressão directamente para dentro do poço, durante o decurso da sessão de imagem. Isso nos permite adquirir algumas imagens das células antes da indução da via e seguir o seu destino após a estimulação. No presente caso, as células foram seguido…

Discussion

Microscopia

O tratamento do poço com ConA é um passo essencial para assegurar uma imagem adequada das células. Porque ConA tem uma baixa solubilidade em PBS (5 mg / ml), o processo de filtração permite a remoção de grandes agregados que se encontram presentes na solução não filtrada e interferem com a imagem latente. Células prender de forma relativamente forte à superfície tratada e a adição da solução de indução não deve perturbar a localização das células, o que permit…

Materials

			Reagent
Yeast Nitrogen Base	ForMedium	CYN6202
CSM amino-acid mix	ForMedium	DCS0011
Concanavalin A	GE Healthcare	17-0450-01
Cycloheximide	Fluka Aldrich Sigma	C7698	Toxic
ySP9			W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34			pRS305 pSTL1 (-800 -0) – quadruple V enus
			Material
Microscope	Nikon	Ti-Eclipse
Microscope control software	Micro-manager	Ver 1.4.11
Incubation chamber	LIS	The Box
Fluorescence light source	Lumencor	SpectraX
Camera	Hamamatsu	Flash 4.0
Flow cytometer	BD	FACS calibur
Sonicator bath	Telesonic	TUC-150
8-well-slide	Thermo Lab-tek	155409
96-well-plate	Matrical bioscience	MGB096-1-2-LG
FACS tube	BD Falcon	352054