نماذج وأساليب لتقييم نقل المخدرات نظم التسليم عبر الحواجز الخلوية
Summary
تتطلب العديد من التطبيقات العلاجية النقل الآمن والفعال للناقلات المخدرات وحمولتها عبر الحواجز الخلوية في الجسم. توضح هذه المقالة على تكييف أساليب أنشئت لتقييم معدل وآلية نقل nanocarriers المخدرات (NCS) عبر الحواجز الخلوية، مثل الجهاز الهضمي (GI) ظهارة.
Abstract
ناقلات ميكرومتر الفرعية (nanocarriers؛ نكس) تعزيز فعالية الأدوية من خلال تحسين القابلية للذوبان والاستقرار، زمن الدوران، والاستهداف، والافراج عنهم. بالإضافة إلى ذلك، يجتاز الحواجز الخلوية في الجسم أمر حاسم لكلا التسليم عن طريق الفم من البلاغات الوطنية العلاجية إلى الدورة الدموية والنقل من الدم إلى الأنسجة، حيث هناك حاجة إلى التدخل. ويتحقق النقل NC عبر الحواجز الخلوية من (ط) الطريق paracellular، عبر تعطيل عابرة من التقاطعات التي التعشيق الخلايا المجاورة، أو (ب) الطريق العابر للخلايا، حيث يتم المنضوية المواد عن طريق الإلتقام، ونقلها عبر خلايا الجسم، ويفرز في المقابل سطح الخلية (transyctosis). تسليم عبر الحواجز الخلوية يمكن أن تيسره اقتران المداواة أو ناقليها مع استهداف وكلاء التي تربط خصيصا لعلامات سطح الخلية المعنية في مجال النقل. هنا، ونحن نقدم أساليب لقياس مدى وآلية النقل NC عبر حاجز خلية النموذج، مبادرة الخوذ البيضاءيتكون الفصل من أحادي الطبقة من الجهاز الهضمي (GI) الخلايا الظهارية نمت على غشاء مسامي تقع في إدراج transwell. ويؤكد تشكيل حاجز نفاذية عن طريق قياس المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (طير)، والنقل بطريق الظهارة من مادة السيطرة، والمناعية من منعطفات ضيقة. على سبيل المثال، تستخدم ~ 200 نانومتر البوليمر البلاغات الوطنية، التي تحمل بضائع والعلاجية والمغلفة مع الأجسام المضادة التي تستهدف محددا سطح الخلية. هو المسمى الأجسام المضادة أو البضائع العلاجية مع 125 أنا النظائر المشعة للبحث عن المفقودين وتضاف نكس المسمى إلى مجلس الشيوخ خلال أحادي الطبقة خلية لفترات متفاوتة من الزمن. ويمكن الكشف عن البلاغات الوطنية المرتبطة الخلايا و / أو نقلها إلى غرفة الأساسي. قياس مجانية 125 I يسمح الطرح الكسر المتدهورة. ويتم تقييم مسار paracellular عن طريق تحديد التغييرات المحتملة الناجمة عن النقل NC لمعلمات حاجز المذكورة أعلاه. ط النقل العابر للخلاياتقدر تحددها معالجة تأثير تحوير الإلتقام وtranscytosis مسارات.
Introduction
الحواجز الخلوية في فعل الجسم كبوابة بين البيئة الخارجية والداخلية المقصورات. هذا هو الحال بالنسبة للبطانة الظهارية التي تفصل بين السطح المعرض من الخارج من الجهاز الهضمي (GI) المسالك ومجرى الدم 1-3. كما تمثل الحواجز الخلوية واجهة بين مجرى الدم وحمة والمكونات الخلوية من الأنسجة والأعضاء. هذا هو الحال بالنسبة للبطانة الداخلية البطانية في الأوعية الدموية، مثل حاجز الدم في الرئة، حاجز الدم في الدماغ، الخ. 1 القدرة على اجتياز هذه الحواجز الخلوية في الجسم أمر حاسم للتسليم كفاءة العوامل العلاجية والتشخيصية إلى الدورة الدموية والأنسجة / الأجهزة التي تحتاج إلى التدخل.
لتحسين تقديم وكلاء علاجية أو تشخيصية، هذه المركبات يمكن تحميلها في nanocarriers ميكرومتر الفرعية (NCS). هذه المركبات لتقديم الأدوية يمكن أن تصاغ مع مجموعة متنوعة منكيمياء والهياكل لتحسين القابلية للذوبان في المخدرات، والحماية، والدوائية، وإطلاق سراح، والتمثيل الغذائي 4،5. البلاغات الوطنية يمكن أيضا أن تكون بين functionalized مع تقارب أو استهداف الأنصاف (مثل الأجسام المضادة، الببتيدات السكريات، الأبتامرات، الخ) لتسهيل الانضمام إلى مناطق الجسم التي تتطلب العمل العلاجي 2،6. يمكن استهداف البلاغات الوطنية لمحددات أعرب على سطح الحواجز الخلوية زيادة تسهيل النقل إلى و / أو عبر هذه بطانات 2،6.
دور نقل المواد بشكل انتقائي بين بيئتين يتطلب بعض ميزات فريدة من نوعها بين طبقات الخلية. واحدة من هذه الميزة قطبية الخلية، حيث الغشاء القمي التي تواجه التجويف تجاويف يختلف من غشاء basolateral موجهة نحو الخلالي الأنسجة، وفيما يتعلق التشكل الغشاء وتكوين الدهون، والنقل، ومستقبلات 2. يتضمن ميزة أخرى junctio بين الخلايانانوثانية التي تربط الخلايا المجاورة. تنظيم البروتينات التي تشكل منعطفات ضيقة، جزيئات الالتصاق صلي على وجه الخصوص (المربيات)، occludins، وclaudins، تعدل وظيفة حاجز للسماح بشكل انتقائي أو لا نقل المواد بين الخلايا، والمعروفة باسم النقل paracellular، مما يسمح بمرور المواد من التجويف ل مساحة basolateral 3. يمكن الربط من العديد من العناصر الطبيعية والاصطناعية (الكريات البيض، والجزيئات، والجسيمات، ونظم لتقديم الأدوية) إلى الحواجز الخلوية في الجسم تحفز الخلايا افتتاح تقاطع، والتي قد تكون عابرة وغير مؤذية نسبيا أو أكثر لفترة طويلة، وبالتالي غير آمنة مع وصول المواد غير المرغوب فيها عبر حاجز 2،5،7-9. بالتالي، هذا المسار يمكن تقييمها من خلال قياس المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (طير) والسلبي نشر paracellular من الجزيئات (وتسمى هنا تسرب paracellular)، حيث انخفضت مقاومة التيار الكهربائي أو زيادة تسرب paracellular من المعهد الوطني للإحصاءمجمع غ في الفضاء basolateral تشير افتتاح تقاطعات الخلية، على التوالي 5،10،11. لتكمل هذه الأساليب، أي من البروتينات مفرق ضيق المذكورة أعلاه يمكن أن تكون ملطخة لتقييم سلامتها، حيث يجب أن يظهر تلطيخ تتركز على الحدود خلية خلية في جميع أنحاء محيط الخلية 5،10،12.
بدلا من ذلك، نظم لتقديم الأدوية التي تستهدف المحددات سطح خلية معينة، مثل تلك المرتبطة حفر المغلفة بالكلاذرين أو invaginations الغشاء على شكل قارورة دعا caveolae، قد يؤدي امتصاص حويصلي في الخلايا عن طريق الإلتقام، وتوفير وسيلة لتوصيل الدواء إلى الخلايا مقصورات 5، 13. بالإضافة إلى ذلك، قد تؤدي إلى الاتجار الإلتقام من الحويصلات عبر خلايا الجسم لاطلاق سراح في الجانب basolateral، وهي ظاهرة تعرف باسم transyctosis، أو النقل العابر للخلايا 14. وبالتالي، معرفة حركية وآلية الإلتقام يمكن أن تستخدم لاستغلال الخلايا والثانية تسليم المخدرات العابر للخلايا، والذي يقدم طريقة آمنة نسبيا والتي تسيطر التسليم مقابل الطريق paracellular. (الإلتقام مثل حالة جزيء التصاق الخلية (CAM) بوساطة) آلية الإلتقام يمكن تقييم مع جهري من الممرات الكلاسيكية (بالكلاذرين وبوساطة caveolin الإلتقام، وmacropinocytosis) أو المسارات غير الكلاسيكية 5،13،15 .
في حين غالبا ما درس الاتجار داخل الخلايا في الآبار القياسية أو coverslips، وعدم وجود حجرة basolateral يمنع الاستقطاب الخلية والقدرة على دراسة النقل عبر طبقات الخلية. للتغلب على هذه العقبة، والنقل عبر الطبقات الوحيدة الخلية تمت دراسة طويلة باستخدام transwell إدراج 10،11،16،17، والتي تتكون من العلوي (القمي) غرفة، غشاء نفاذية مسامية حيث تعلق الخلايا وتشكيل أحادي الطبقة ضيقة، وأقل (basolateral) غرفة (الشكل 1). في هذا التكوين، يمكن قياس النقل فيقمي، لbasolateral الاتجاه من خلال إدارة العلاج في الغرفة العليا، وبعد النقل من خلال أحادي الطبقة الخلية وغشاء مسامي الكامنة، وجمع أخيرا المتوسطة في مجلس النواب لتقدير حجم المواد المنقولة. ويمكن أيضا نقل في الاتجاه basolateral-لقمية تقاس الإدارة الأولية إلى انخفاض الغرفة وجمع لاحقة من مجلس الشيوخ 5،10،12،16. توجد تقنيات مختلفة للتحقق من تشكيل حاجز نفاذية على transwells، بما في ذلك طير والمقايسات النقل paracellular، كما هو موضح أعلاه. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إزالة عامل التصفية منفذة على الخلايا التي يتم تربيتها لتحليل التصوير (مثل مضان، مبائر، المجهر الإلكتروني)، وكذلك المصادقة على نموذج أحادي الطبقة المحمولة، فضلا عن آلية النقل. اختيار نوع الغشاء، والذي يتوفر في أحجام مختلفة المسام، والمواد، والمناطق السطحية، ويعتمد على مختلف الواقعالتمرير مثل حجم المواد أو الأشياء المراد نقلها، نوع من الخلايا، وطريقة التصوير 16،18-20. Transwell إدراج أيضا تسهيل التحكم ودقيقة الكمي النقل بالمقارنة مع أنظمة الثدييات المعقدة، كما هي معروفة أحجام الغرف ومساحة سطح الخلية الثوابت. في حين يتم التخلص من العديد من العوامل التي تدخل في الجسم الحي في التسليم، بما في ذلك وجود مخاط الأمعاء، إجهاد القص، والإنزيمات الهضمية، الخلايا المناعية وغيرها، هذا على نطاق صغير في النموذج المختبر يوفر معلومات أولية مفيدة بشأن النقل.
كمثال لتوضيح تكييف هذه الأساليب لدراسة النقل NC عبر الحواجز الخلوية 10،11،16،17، ونحن هنا وصف الحالة التي كان على غرار القدرة على الانتقال NC عبر ظهارة GI عن طريق تقييم مرور تسليم المخدرات نموذج النظام من خلال أحادي الطبقة من الإنسان غدية القولون الظهارية (كاتشو-2) الخلايا. لهذا الغرض، جوكانت أذرع مثقف في إدراج transwell، على 0.8 ميكرومتر المسام البولي ايثيلين تيريفثاليت (PET) تصفية (6.4 مم)، وهو شفاف، ويمكن استخدامها للتصوير المجهري. يتم التحقق من صحة وضع حاجز نفاذية عن طريق قياس طير والنقل القمي، لbasolateral من مادة السيطرة، والزلال، والتصور مضان المجهري عنصر من منعطفات ضيقة، والبروتين occludin. ويستخدم نموذج من البوليمر استهدفت NC، ويتألف من 100 نانومتر، الجسيمات النانوية البوليسترين nonbiodegradable. والمغلفة البلاغات الوطنية عن طريق الامتزاز السطح مع الأجسام المضادة التي تستهدف وحدها أو مزيج من الأجسام المضادة التي تستهدف والبضائع العلاجية، حيث يمكن أن توصف إما المكون مع 125 أنا النظائر المشعة للبحث عن المفقودين. في المثال المحدد، يعترف الضد التصاق بين الخلايا جزيء-1 (ICAM-1)، أعرب البروتين على سطح GI الظهارية (وغيرها) الخلايا، وهو ما ثبت لتسهيل داخل الخلايا والعابر للخلايا س النقل ناقلات المخدرات و وحمولتها 21. البضائع هو ألفا غالاكتوزيداز (α غال)، انزيم العلاجية المستخدمة لعلاج مرض فابري، وهو اضطراب التخزين الليزوزومية الوراثية 22.
الخدمة المدنية القومية المغلفة، من حوالي 200 نانومتر في الحجم، وتضاف إلى غرفة قمي أكثر من أحادي الطبقة الخلية وحضنت في 37 درجة مئوية لفترات متفاوتة من الزمن، وبعد ذلك يمكن أن يتم الكشف عن 125 وأنا على البلاغات الوطنية المرتبطة أحادي الطبقة الخلية و / أو نقل إلى غرفة basolateral أدناه الخلايا. تقرير إضافية مجانية 125 I يسمح الطرح الكسر المتدهورة وتقدير النقل NC المغلفة. ويتم تقييم آلية النقل من خلال دراسة مزيد من التغييرات في نفاذية حاجز المتعلقة الطريق paracellular، من خلال المعلمات المذكورة أعلاه، في حين يتم تحديد النقل العابر للخلايا من خلال دراسة التغيرات في مجال النقل عند تحوير مسارات الإلتقام وtranscytosis.
ontent "> هذه الأساليب توفير معلومات قيمة حول نماذج حاجز الخلوية، مدى ومعدل نقل نظام تسليم المخدرات، وآلية مثل النقل، والسماح تماما تقييم إمكانات لتسليم المخدرات عبر الحواجز الخلوية.Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام الأساليب التي تمت مناقشتها أعلاه، يمكن تأسيس نموذج خلية لدراسة نقل البلاغات الوطنية المستهدفة عبر الحواجز الخلوية، مثل المثال المنصوص عليها كاتشو-2 الخلايا الظهارية، والتي هي ذات الصلة لتقييم النقل من التجويف GI في الدم في حالة نظم لتقديم الأدوية عن طريق الف…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل الزمالة من معهد هوارد هيوز الطبي والمؤسسة الوطنية للعلوم إلى RG، والأموال التي منحت لSM من قبل المعاهد الوطنية للصحة (المنحة R01-HL98416) وجمعية القلب الأمريكية (المنحة 09BGIA2450014).
Materials
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
References
- Deli, M. A. Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).
- Mrsny, R. J. Lessons from nature: “Pathogen-Mimetic” systems for mucosal nano-medicines. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Torchilin, V. Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers. Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).
- Sadekar, S., Ghandehari, H. Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).
- Muro, S. Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems. J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).
- Volkheimer, G. Persorption of particles: physiology and pharmacology. Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).
- Dejana, E. Endothelial cell-cell junctions: happy together. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).
- Jung, T., et al. Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake. Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
- Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport. Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).
- Bareford, L. M., Swaan, P. W. Endocytic mechanisms for targeted drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).
- Tuma, P. L., Hubbard, A. L. Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).
- Muro, S., et al. A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1. J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).
- Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption. Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).
- Delie, F., Rubas, W. A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).
- Kuhnline Sloan, C. D., et al. Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier. Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).
- Kasper, J., et al. Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro. Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).
- Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1. J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).
- Hsu, J., et al. Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease. J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).
- Schmiedlin-Ren, P., et al. Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins. Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).
- Hughes, J., Crowe, A. Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics. J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).
- Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport. J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).
- Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).
- Kapus, A., Szaszi, K. Coupling between apical and paracellular transport processes. Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).
- Hood, E. D., et al. Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo. J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).
- Simone, E., et al. Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124. Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).
- Vercauteren, D., et al. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
