Modelle und Methoden zum Transport von Drug Delivery Systems über zelluläre Barrieren Bewerten
Summary
Viele therapeutische Anwendungen erfordern sicheren und effizienten Transport von Arzneistoffträger und ihre Ladungen über zelluläre Barrieren im Körper. Dieser Artikel beschreibt eine Anpassung der etablierten Verfahren, um die Geschwindigkeit und der Mechanismus der Medikamententransport Nanoträger (NCS) über zelluläre Barrieren, wie der gastrointestinalen (GI) Epithel auszuwerten.
Abstract
Sub-Mikrometer-Träger (Nanotransporter; NCs) verbessern die Wirksamkeit von Arzneimitteln durch Verbesserung der Löslichkeit, Stabilität, Zirkulationszeit, Targeting, und loslassen. Zusätzlich ist für sowohl die orale Verabreichung von therapeutischen NCs in den Kreislauf und den Transport von Blut in Gewebe, in denen eine Intervention erforderlich ist Laufen Zellbarrieren im Körper. NC Transport durch Zellbarrieren wird erreicht durch: (i) der parazellulären Weg, über vorübergehende Unterbrechung der Übergänge, die benachbarte Zellen oder (ii) die transzelluläre Route, wo Materialien durch Endozytose internalisiert, in dem Zellkörper transportiert und sezerniert verzahnen auf der gegenüberliegenden Zelloberfläche (transyctosis). Liefer über zelluläre Barrieren können durch Kopplung Therapeutika oder ihre Träger mit Targeting-Mittel, die spezifisch an Zelloberflächenmarker in Transport beteiligt binden erleichtert werden. Hier stellen wir Methoden, um das Ausmaß und den Mechanismus der NC-Transport über ein Modell Zellbarriere, whi messenLm besteht aus einer Monolage von gastrointestinalen (GI) Epithelzellen auf einer porösen Membran in einem Transwell-Einsatz angewachsen. Bildung einer Permeabilitätsbarriere durch Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) transepithelialen Transport einer Kontrollsubstanz und Immunfärbung von tight junctions bestätigt. Als Beispiel sind ~ 200 nm NCs Polymer verwendet, das eine therapeutische Ladung tragen und mit einem Antikörper, der ein Zelloberflächen-Determinante zielt beschichtet. Der Antikörper oder das therapeutische Ladung mit 125 I-Radioisotop zur Verfolgung markiert und etikettiert NCs mit der oberen Kammer über die Zellschicht für unterschiedliche Zeiträume zugesetzt. NCs zu den Zellen und / oder an der darunterliegenden Kammer transportiert assoziiert erkannt werden. Messung von freiem 125 I ermöglicht Subtraktion des abgebauten Fraktion. Die parazellulären Weg ist durch die potenzielle Veränderung von NC Transport zu den oben beschriebenen Sperrparameter verursacht beurteilt. Transzellulären Transport is, indem sie die Wirkung der Modulation Endozytose und Transzytose Wege bestimmt.
Introduction
Zellbarrieren im Körper als Gateway zwischen der äußeren Umgebung und Innenfächer. Dies ist der Fall für die epitheliale Auskleidung Trennen des außen freiliegenden Oberfläche des Magen-Darm-Trakt (GI) und den Blutkreislauf 1-3. Zellbarrieren auch stellen die Schnittstelle zwischen dem Blutstrom und dem Parenchym und zellulären Komponenten von Geweben und Organen. Dies ist der Fall für die innere endotheliale Auskleidung der Blutgefäße, wie beispielsweise Blut-Lungen-Schranke, Blut-Hirn-Schranke, etc. 1. Die Fähigkeit, diese Zellbarrieren im Körper zu durchlaufen ist entscheidend für die effiziente Abgabe von therapeutischen und diagnostischen Mitteln in den Kreislauf und Gewebe / Organen, wo Eingreifen erforderlich ist.
Die Lieferung von therapeutischen oder diagnostischen Mittel zu verbessern, können diese Verbindungen in sub-Mikrometer Nanoträger (NCS) geladen werden. Diese Arzneimittelabgabeträger kann mit einer Vielzahl von formuliert werdenChemie und Strukturen des Drogen Löslichkeit, Schutz, Pharmakokinetik, Freigabe, 4,5 und Stoffwechsel zu optimieren. Nanokristalle können auch mit Affinität oder Targeting-Einheiten (z. B. Antikörper, Peptide, Zucker, Aptamere etc.) funktionalisiert werden, um die Haftung zu Bereichen des Körpers, wo die therapeutische Wirkung benötigt wird 2,6 zu erleichtern. Targeting von NCs Determinanten auf der Oberfläche der Zellbarrieren ausgedrückt kann der Transport noch weiter zu erleichtern, in und / oder über diese Auskleidungen 2,6.
Die Rolle der selektiven Transport von Stoffen zwischen zwei Umgebungen erfordert bestimmte einzigartige Eigenschaften unter Zellschichten. Eine solche Funktion ist die Zellpolarität ist, wobei die apikale Membran, die das Lumen der Hohlräume hängt von der basolateralen Membran auf das Gewebe Interstitium orientiert, in Bezug auf Membranmorphologie und Zusammensetzung von Lipiden, Transporter, Rezeptoren und 2. Ein weiteres Merkmal beinhaltet inter junctions, die benachbarte Zellen. Regulierung der Proteine, die Tight Junctions, insbesondere junctional Adhäsionsmoleküle (Staus), Occludine und Claudinen bilden, modulieren die Barrierefunktion, um selektiv zu ermöglichen oder nicht Transport von Substanzen zwischen den Zellen, wie parazellulären Transport bekannt, die den Durchgang von Material aus dem Lumen der basolateralen Raum 3. Bindung von vielen natürlichen und synthetischen Elementen (Leukozyten, Moleküle, Partikel, und Wirkstoffabgabesysteme), um Zellbarrieren im Körper Zellöffnung Übergang zu induzieren, die flüchtig und relativ harmlose oder mehr verlängert werden kann, und daher unsicher Zutritt unerwünschten Substanzen über die Barriere 2,5,7-9. Folglich kann dieser Weg durch das Messen der transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) und passive parazelluläre Diffusion von Molekülen (hierin als parazelluläre Leckage) bewertet werden, wobei verringerten Widerstand auf einen elektrischen Strom oder eine erhöhte parazelluläre Leckage eines inert Verbindung in der basolateralen Raum geben Eröffnung der Zellverbindungen, bzw. 5,10,11. Um diese Verfahren zu ergänzen, kann jeder der oben aufgeführten tight junction-Proteine gefärbt werden, um ihre Integrität zu beurteilen, wo Färbung sollte an den Zell-Zell-Grenzen auf der ganzen Peripherie der Zelle konzentriert 5,10,12 erscheinen.
Alternativ Arzneimittelabgabesystemen, die spezifische Zelloberflächen-Determinanten, wie diejenigen, die Clathrin-beschichteten Vertiefungen oder kolbenförmigen Einstülpungen Membran genannt Caveolae assoziiert Ziel kann vesikuläre Aufnahme in die Zellen durch Endozytose auszulösen, wodurch ein Weg für die Arzneimittelabgabe zu intrazellulären Kompartimenten 5, 13. Darüber hinaus kann die Endozytose von Vesikeln mit dem Menschenhandel über die Zellkörper für die Freigabe an der basolateralen Seite, ein Phänomen, wie transyctosis bekannt oder transzellulären Transport 14 führen. Daher kann die Kenntnis der Kinetik und Mechanismus der Endozytose verwendet, um intrazelluläre ein auszunutzennd transArzneimittelAbgabe, die einen relativ sicheren und kontrollierten Art der Verabreichung bietet gegenüber den parazellulären Weg. Der Mechanismus der Endozytose kann mit Modulatoren der klassischen Wege (Clathrin-und Caveolin-vermittelte Endozytose und Makropinozytose) oder nicht-klassischen Wege ausgewertet werden ((CAM)-vermittelte wie bei der Zelladhäsionsmolekül Endozytose) 5,13,15 .
Während intrazellulären Transport ist oft in Standard Brunnen oder Deck studiert, das Fehlen einer basolateralen Fach schließt Zellpolarisation und die Fähigkeit, den Transport durch Zellschichten zu untersuchen. Um dieses Hindernis zu überwinden, hat den Transport über lange Zellmonoschichten untersucht mit Transwell-Einsätze 10,11,16,17, die aus einem oberen (apikal) Kammer, einem porösen durchlässige Membran, wo Zellen befestigen und bilden eine dichte Monoschicht bestehen, und eine untere worden (basolateralen) Kammer (Abbildung 1). In dieser Konfiguration kann der Transport in die gemessen werdenapikal-zu-basolateral-Richtung durch die Verabreichung einer Behandlung in der oberen Kammer, nach dem Transport durch die Zellmonoschicht und der darunterliegenden porösen Membran, und schließlich das Sammeln des Mediums in der unteren Kammer für die Quantifizierung des transportierten Materials. Transport in der basolateralen-to-apikal kann auch durch anfängliche Verabreichung in die untere Kammer und die anschließende Sammlung aus der oberen Kammer 5,10,12,16 gemessen werden. Es gibt verschiedene Techniken, um die Bildung der Permeabilitätsbarriere auf Transwells, einschließlich TEER und parazellulären Transport-Assays zu überprüfen, wie oben beschrieben. Darüber hinaus kann das permeable Filter auf denen Zellen kultiviert werden zur Bildanalyse (z. B. durch Fluoreszenz, konfokale, Elektronenmikroskopie) entfernt werden, wie weitere Validierung der Zellmonolayer-Modell sowie dem Transportmechanismus. Auswahl des Membrantyps, die in unterschiedlichen Porengrößen, Materialien und Oberflächen verfügbar ist, hängt von verschiedenen factors wie die Größe von Stoffen oder Gegenständen, die transportiert werden, Zelltyp und Bildgebungsverfahren 16,18-20. Transwell-Einsätze im Vergleich zu komplexen Säugersystemen als Volumina der Kammern und der Zelloberfläche sind bekannte Konstanten gesteuerte und genaue Quantifizierung der Transport erleichtert auch. Während viele Faktoren bei der in-vivo-Lieferung beteiligt sind beseitigt, einschließlich der Anwesenheit von Darmschleim-, Scher-Stress, Verdauungsenzyme, Immunzellen etc., bietet dieses kleinen Maßstab in vitro-Modell nützlich vorläufige Informationen über Transport.
Als ein Beispiel, um die Anpassung dieser Verfahren an NC Transport durch Zellbarrieren 10,11,16,17 studieren zu verdeutlichen, beschreiben wir hier einen Fall, wo das Potenzial für die NC-Transport über die GI Epithel wurde durch die Beurteilung Gang eines Drug-Delivery-Modell modelliert System durch eine Monoschicht von menschlichen epithelialen kolorektalem Adenokarzinom (Caco-2-Zellen). Hierzu cEllen wurden in Transwell-Einsätze, auf einem 0,8 &mgr; m Poren Polyethylenterephthalat (PET)-Filter (6,4 mm Durchmesser), die transparent ist und kann zur Mikroskopie verwendet werden. Der Status der Permeabilitätsbarriere durch Messen TEER, apikale zu basolateralen Transport einer Kontrollsubstanz, Albumin und Fluoreszenzmikroskopie Visualisierung eines Elements der tight junctions, Occludinproteins validiert. Ein Modell des Ziel NC Polymer verwendet wird, die aus 100 nm, Polystyrol nicht biologisch abbaubaren Nanopartikel. NCs durch Oberflächenadsorption mit einem Targeting-Antikörper allein oder einer Kombination aus einer Targeting-Antikörper und einem therapeutischen Ladung, wobei jede Komponente mit 125 I-Radioisotop zur Verfolgung markiert werden beschichtet. Im gewählten Beispiel erkennt interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) der Antikörper, exprimiert ein Protein auf der Oberfläche von Epithelzellen GI (und anderer Zellen), von dem gezeigt wurde, um die intrazelluläre und transzellulären Transport o erleichtern f Wirkstoffträger und ihre Ladungen 21. Die Ladung ist alpha-Galactosidase (α-Gal), ein therapeutisches Enzym zur Behandlung der Fabry-Krankheit, einer genetischen lysosomalen Speicherkrankheit 22 verwendet.
Die beschichteten Nanokristallen, von etwa 200 nm groß sind, um die apikale Kammer über der Zellschicht für unterschiedliche Zeiträume, gegeben und bei 37 ° C inkubiert, wonach 125 mit der Zell-Monoschicht und / oder die zugehörige kann ich auf NCs erkannt werden auf die basolaterale Kammer unter den Zellen transportiert. Zusätzliche Bestimmung von freiem 125 I ermöglicht Subtraktion des abgebauten Fraktion und Schätzung von beschichteten NC Transport. Der Transportmechanismus wird durch die Veränderungen der Durchlässigkeit der Barriere in Bezug auf den parazellulären Weg, durch den oben beschriebenen Parametern, während transzellulären Transport wird durch die Veränderungen der Transportwege bei der Modulation der Endozytose und Transzytose bestimmt beurteilt.
NHALT "> Diese Methoden liefern wertvolle Informationen über die Zellbarriere Modelle, das Ausmaß und die Geschwindigkeit des Transports von Drug-Delivery-System, und den Mechanismus solcher Transport, insgesamt die Auswertung des Potentials für die Arzneimittelabgabe über zelluläre Barrieren.Protocol
Representative Results
Discussion
Unter Verwendung der oben diskutierten Verfahren kann ein Zellmodell für die Untersuchung der Zieltransport NCs über zelluläre Barrieren geschaffen werden, wie das für Caco-2-Epithelzellen, die relevant für die Bewertung der Verkehrs GI Lumen in dem Blut in dem Fall vorgesehen ist beispiels der oralen Medikamentenabgabesysteme. Kultivierung von GI epithelialen Zell-Monoschichten in Transwell-Einsätzen aktiviert Messung TEER und Fluoreszenz-Immunfärbung von tight junctions, um die Bildung einer Zelle Permeabilitä…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Howard Hughes Medical Institute und der National Science Foundation zu RG, und die Mittel, um SM von den National Institutes of Health (Grants R01-HL98416) und der American Heart Association (Zuschuss 09BGIA2450014) ausgezeichnet unterstützt.
Materials
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
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