Promotion of Survival og Differensiering av nevrale stamceller med fibrin og vekstfaktor Cocktails etter alvorlig ryggmargsskade
Summary
Fibrin-matriser inneholdende vekstfaktorer ble anvendt for å beholde podet neural stamceller i områder med fullstendig ryggmarg transeksjon. Podet celler helt fylt lesjon hulrom og differensiert i flere nevrale celletyper, inkludert nevroner som utvidet axons inn host ryggmargen over lange avstander.
Abstract
Nevrale stamceller (NSCs) kan selv fornye og differensiere i nevroner og gliaceller. Transplanterte NSCs kan erstatte tapte nerveceller og gliaceller etter ryggmargsskade (SCI), og kan danne funksjonelle releer å koble på ryggmargssegmenter over og under en lesjon. Tidligere studier innpoding nevrale stamceller har vært begrenset av ufullstendig transplantatoverlevelse i den ryggmargslesjon hulrom. Videre sporing av pode celle overlevelse, differensiering, og prosessen forlengelse hadde ikke blitt optimalisert. Til slutt, i tidligere studier, dyrkede rotte NSCs ble typisk rapportert til å differensiere i gliaceller når podet til den skadede ryggmargen, i stedet for neuroner, med mindre skjebne ble kjørt til en bestemt celletype. For å løse disse problemene, har vi utviklet nye metoder for å forbedre overlevelse, integrering og differensiering av NSCs til nettsteder med enda alvorlig SCI. NSCs ble nylig isolert fra embryonale dag 14 ryggmargen (E14) fra en stabil transgen Fischer 344 rotte linje som uttrykker grønn fluorescent protein (GFP) og ble innebygd i en fibrin matrise som inneholder vekstfaktorer; denne formulering beregnet til å beholde podet celler i lesjonen hulrom og støtte celleoverlevelse. NSCs i fibrin / vekstfaktor cocktail ble implantert to uker etter thorax nivå-3 (T3) komplett ryggmargs transections, og dermed unngå perioder på betennelse. Resulterende grafts helt fylt lesjon hulrom og differensiert i begge nevroner, som utvidet axons i verten ryggmargen enn bemerkelsesverdig lange avstander, og gliaceller. Grafts av dyrkede humane NSCs uttrykker GFP resultert i tilsvarende funn. Således er metoder som er angitt for å bedre neural stamcelle poding, overlevelse og analyse av in vivo-resultater.
Introduction
Ryggmargsskade (SCI) ofte skader ikke bare hvite substans traktene som bærer signaler til og fra hjernen, men også den sentrale grå materie, forårsaker segmental tap av interneurons og motoriske nerveceller. Konsekvensen av SCI er tap av både motorisk og sensorisk funksjon under lesjonen. Dessverre gjør den voksne sentralnervesystemet (CNS) ikke spontant regenerere, noe som resulterer i permanente funksjonelle underskudd ett. Derfor er rekonstruksjon av den skadde voksne ryggmargen og bedring i motorisk, sensorisk og autonom funksjon et viktig mål for SCI forskning. Nevrale stamceller (NSCs), enten direkte isolert fra embryonale eller voksen CNS, er overbevisende kandidat celler til å erstatte tapte nerveceller og gliaceller. Videre disse cellene har potensial til å danne nye funksjonelle releer for å gjenopprette aksonal ledning på tvers av en lesjon området 2,3.
Til dags dato har det ikke vært en detaljert forklaring av den anatomiske, electrophysiological og atferdsmessige effekter av nevronale relé dannelsen av transplanterte NSCs etter alvorlig SCI. Det er flere grunner til dette: For det første, transplanterte NSCs eller fosterets CNS vev overleve dårlig når podet inn store lesjon hulrom. Tidligere studier viser betydelig tidlig celle tap, etterlot store tomme cystisk lesjon hulrom 4,5. I noen studier podet cellene deretter vil dele og fylle lesjon hulrom 4,5, men dette kan skje etter en forsinkelse på dager til uker, og påfølgende lesjon nettstedet fylling kan ikke være komplett eller konsistent. For det andre, et effektivt system for sporing som gir lyd data på mobilnettet overlevelse, differensiering / modning, og utvekst av transplantert NSCs manglet. De fleste tidlige studier utnyttet antegrad og retrograd merking for å spore aksonale anslag fra transplantasjoner 2,3. Imidlertid er disse teknikker bare delvis og ofte uklart merket aksonale projeksjoner som følge av podet celler, og tracer-metode er subject for å artifakter forårsaket av fargestoffet lekker forbi de implanterte celler. Andre grupper brukte menneskelige spesifikke nevronale markører å merke aksonale anslag etter transplantasjon menneskelige foster NSCs inn skadde gnager ryggmarg 5,6 av. Men i disse studiene, de xenografts ikke konsekvent overleve godt. Nylig ble viral levering av GFP reporter genet brukes til å merke kultur NSCs 7,8. Men GFP uttrykk var ofte inkonsekvent og kan bli nedregulert 7. Nylig har anvendelse av transgene donor mus eller rotter stabilt uttrykte reporter-genet, GFP, eller human placental alkalisk fosfatase, er dramatisk forbedret sporing av transplanterte nevrale stamceller / stamceller in vivo 9,11. Tredje, flere studier tyder på at in vitro dyrkede rotte NSCs avledet fra enten embryonale eller voksen CNS utelukkende differensiere i gliacellene linjene når transplantert inn i miljøet av den intakt eller skadet voksen spinal cord 7,12,13, til tross for det faktum at disse nevrale stamceller er i stand til å differensiere til neuroner og gliaceller både in vitro, noe som indikerer at lokale omgivelser kan diktere skjebnen til stamceller. Alternativt kan dyrkede NSCs, spesielt de som stammer fra voksen CNS, har iboende defaulty eiendom å differensiere i gliacellene linjene i vivo 13.
På grunn av begrensningene omtalt ovenfor, vår gruppe har nylig utviklet en ny protokoll for å forbedre embryonale NSC sporing, overlevelse, og differensiering / modning i den hardt skadde voksne ryggmargen. Kort fortalt, vi begynte med en stabil transgen Fischer 344 rotte inbreed linje som uttrykker en GFP reporter gen som opprett GFP uttrykk etter in vivo transplantasjon 14. Deretter brukte vi fersk isolerte NSCs fra embryonale dag 14 Fischer 344 ryggmarg, et utviklingsstadium som beholder potensial til å generere både nerveceller og gliaceller. Til slutt, vi innebygdfersk dissosiert NSCs inn en fibrin matrise som inneholder vekstfaktorer 15-17 å beholde cellene og jevnt distribuere dem i en stor lesjon hulrom, med formål å støtte pode celle overlevelse, differensiering og integrasjon. Grafts ble anbrakt i områder av T3 fullstendige tran, to uker etter ryggmargsskade. Disse podet celler konsekvent fylt komplett transider og differensiert i rikelig nevroner som utvidet stort antall axoner i vertsryggmargen over lange avstander 18. Lignende resultater ble oppnådd ved hjelp av dyrkede humane nevrale stamceller grafts til immun-mangel rotter 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
En av de største hindringene for NSC transplantasjon i den skadde ryggmargen er dårlig overlevelse i lesjonen sentrum. Eventuelle hull eller hulrom i lesjonen området potensielt kan redusere eller svekke dannelsen av funksjonelle nevrale releer mellom supra axoner og atskilt ryggmargssegmenter under skaden. Dessuten kan dårlig overlevelse av podet NSCs påvirke deres integrasjon med vertsvevet, og dermed redusere tilkobling av podet neuroner med verts neuroner. Potensielle mekanismer for å forklare celle tap omfatt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Rat Resource and Research Center, University of Missouri, Columbia, Missouri, for å gi GFP rotter; Neuralstem Inc. for å gi humane nevrale stamceller. Dette arbeidet ble støttet av Veterans Administration, NIH (NS09881), kanadiske Spinal Research Organization, Den Craig H. Neilsen Foundation, og Bernard og Anne Spitzer Charitable Trust.
Materials
| Reagents | Company | Catalogue | Comment |
| Fibrinogen(rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF(human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1(mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1X Final Concentration: 1X |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 1.3 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5 -5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
Note, use human reagents for grafts of human NSCs |
References
- Ramon y Cajal, S. In Degeneration and regeneration of the nerve system. , (1991).
- Jakeman, L. B., Reier, P. J. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions. J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).
- Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6, 103-121 (1999).
- Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord. Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).
- Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions. Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).
- Wictorin, K., Björklund, A. Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord. Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).
- Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways. Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).
- Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).
- Lepore, A. C., Fischer, I. Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord. Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).
- Gaillard, A., et al. Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons. Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).
- Remy, S., et al. New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy. Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).
- Cao, Q. L., et al. Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage. Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).
- Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord. Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).
- Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus. Biotechniques. 41, 715-719 (2006).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons. J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).
- Kadoya, K., et al. Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury. Neuron. 64, 165-172 (2009).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Coumans, J. V., et al. Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins. J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).
- Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device. J Vis Exp. (305), (2007).
- Yan, J., et al. Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord. PLoS Med. 4 (2), e39 (2007).
- Popovich, P. G. Building bridges for spinal cord repair. Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).
- Catelas, I. Fibrin. Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).
- Petter-Puchner, A. H., et al. The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury. Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Deister, C., Schmidt, C. E. Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth. Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).
