Culture de cellules humaines épithéliales nasales à l'interface Air Liquide

Summary

Cellules épithéliales nasales, obtenues par grattage superficiel de la biopsie des volontaires humains, sont expansées et transférées sur des inserts de culture tissulaire. Après avoir atteint la confluence, les cellules sont cultivées à l'interface air-liquide, ce qui donne des cultures de cellules ciliées et non ciliées. Cultures de cellules épithéliales nasales différenciées fournissent des modèles expérimentaux viables pour l'étude de la muqueuse respiratoire.

Abstract

Les modèles in vitro en utilisant des cellules epitheliales primaires humaines sont essentiels à la compréhension des fonctions principales de l'épithélium des voies respiratoires dans le cadre d'infections microbiennes ou des agents inhalés. Des comparaisons directes de cellules obtenues à partir de populations malades permettent de caractériser différents phénotypes et disséquer les mécanismes sous-jacents de médiation changements dans la fonction des cellules épithéliales. La culture de cellules épithéliales provenant de la région trachéo-bronchique humain a été bien documenté, mais est limitée par la disponibilité de tissu pulmonaire humain ou de caractère invasif associé à l'obtention de biopsies bronchiques les brosses. Cellules épithéliales nasales sont obtenus par biopsies superficielles nasale de gratter beaucoup moins invasives et les sujets peuvent être biopsiés plusieurs fois, sans effets secondaires importants. En outre, le nez est le point pour le système respiratoire d'entrée et donc l'un des premiers sites à être exposés à tout type de stress d'origine atmosphérique, tels que des agents microbiens, polluants ou allergènes.

Brièvement, les cellules épithéliales nasales obtenues à partir de volontaires humains sont expansés sur des plaques de culture revêtues de tissu, et ensuite transférés sur des inserts de culture cellulaire. Après avoir atteint la confluence, les cellules continuent à être cultivées à l'interface air-liquide (ALI), pendant plusieurs semaines, ce qui crée plus physiologiquement conditions pertinentes. La condition de culture ALI utilise des milieux définis menant à un épithélium différencié qui présente des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles similaires à l'épithélium nasal humain, avec des cellules ciliées, et la fois la production de mucus. des inserts de culture tissulaire avec des cellules épithéliales nasales différenciées peuvent être manipulées dans une variété de façons en fonction des questions de recherche (traitement avec des agents pharmacologiques, la transduction avec des vecteurs lentiviraux, l'exposition à des gaz ou de l'infection par des agents microbiens) et analysés pour de nombreux paramètres différents, allant de voies cellulaires et moléculaires, ch fonctionnelleanges, morphologie, etc

Dans les modèles in vitro de cellules épithéliales nasales humaines différenciées permettra aux enquêteurs de répondre roman et questions de recherche importantes en utilisant des modèles expérimentaux organotypiques que reproduire en grande partie de l'épithélium nasal in vivo.

Introduction

Objectif de la technique

Les cellules épithéliales (ECS) dans les voies respiratoires sont parmi les premiers sites à être directement exposés à des facteurs de stress environnementaux inhalés, comme les agents pathogènes, des allergènes ou polluants atmosphériques. CE sont plus un obstacle structurel: Ils agissent comme un standard pour initier et réguler la réponse immunitaire respiratoire ^1-3 par la libération de médiateurs solubles ^4-6 et l'expression de ligands / récepteurs sur leur surfactant ^7-9. Bien que des lignées de cellules immortalisées peuvent être utilisés comme modèles pour étudier les EC respiratoires in vitro, ils ne parviennent pas à se différencier en des populations cellulaires hétérogènes constitués de cellules ciliées polarisée et de la production de mucus, similaire à ce qui est observé in vivo. Pour résumer les caractéristiques importantes de l'épithélium respiratoire observée in vivo, les EC des voies respiratoires primaires peuvent être utilisées. Par conséquent, notre objectif était d'optimiser notre méthode utilisant nasale EC (CNE) a obtenu des volontaires humains. Les CNE sont étendues et mises en culture in vitro, ce qui donne un modèle de culture de cellules différenciées de CNE qui imite un grand nombre des caractéristiques de l'épithélium nasal vu in vivo.

Raisonnement

L'utilisation de modèles in vitro avec EC primaires humains imitant dans la situation in vivo – comme décrit dans cette étude – offre des possibilités uniques pour étudier les différences spécifiques de la maladie d'ECS, les paramètres physiologiques associés à l'épithélium des voies respiratoires, ou les interactions entre les CE et d'autres types de cellules, telles que les cellules dendritiques ^10, les cellules tueuses naturelles ¹¹ ou des macrophages. Plusieurs procédés existants utilisent les EC bronchiques, qui peuvent être obtenus par l'intermédiaire de biopsies invasive de la brosse au cours de bronchoscopies, ou à partir de tissus pulmonaires autrement mis au rebut ^{12 à 17.} En outre, les sources commerciales pour obtenir des voies respiratoires humaines cultures de cellules épithéliales différenciées entièrement existent (Modèle EpiAirway de MatTek, Ashland, MA, Cloneticsde Lonza, Bâle, Suisse, MucilAir de Epithelix Sars, Genève Suisse), où les enquêteurs peuvent choisir parmi différents bailleurs de fonds. Cependant, à cause de la piscine limité de cellules épithéliales disponibles dans le commerce, limitées ou ensemble de paramètres prescrits, le coût associé à l'obtention commerce respiratoire humain primaire EC, et l'accès limité aux tissus pulmonaires jetés ou tissu fraîchement obtenue de biopsie bronchique humaine, interdisent de nombreux chercheurs de mener des études dans complètement différenciées EC des voies respiratoires humaines. Par conséquent, nous avons décidé de développer une technique qui 1) utiliser CNE humains non invasive obtenus, 2) fournir un protocole rendement des cultures de différenciée épithélium respiratoire humain, et 3) être reproductible dans la plupart des paramètres de laboratoire avec une infrastructure existante de culture de tissus.

Avantages par rapport aux techniques / modèles existants

Obtention CNE frais, par rapport à bronchique ou petit voies EC, est beaucoup moins invasive, individuels peut être biopsiés plusieurs fois, sans effets secondaires importants, et des biopsies superficielles gratter nasales peuvent être menées dans des populations malades qui ne seraient pas admissibles à des bronchoscopies liées à la recherche. Non invasives biopsies superficielles gratter pour obtenir CNE permettent à l'enquêteur pour définir les spécifications des donateurs a priori, y compris l'âge, le sexe, l'état de la maladie, etc, conformément à l'objectif de la recherche à faire. Ainsi, lors de la conception des études de recherche enquêteurs ne sont pas limités par les tissus disponibles en clinique / de spécimens épithéliales, acheter des modèles de culture cellulaire différenciées coûteux auprès de fournisseurs commerciaux, ou la conception des études de bronchoscopie envahissantes. En outre, la facilité à obtenir CNE augmente la capacité de mener des expériences dans les cellules de différents bailleurs de fonds, ce qui améliore la validation statistique des résultats observés. Enfin, le nez est l'un des premiers sites à être exposés à toute sorte de facteurs de stress dans l'air. Ainsi, en générant organotypiqueLes systèmes de culture in vitro mimant l'épithélium nasal sont utiles pour étudier l'inhalation de particules virales, des polluants, des allergènes, ou des gaz, qui peuvent être facilement atteintes par l'utilisation de ce système de culture cellulaire.

Protocol

Une. Préparer plastique Ware: Manteau Plate Ajouter 500 ul PureCol (1:100 dilué avec de l'eau stérile) dans chaque puits d'une plaque à 12 puits. Incuber à 37 ° C dans un incubateur pendant 30 min, retirer le PureCol et rincer avec du HBSS juste avant les cellules sont ajoutées à la plaque (voir l'étape 3.1 ci-dessous). 2. L'obtention et le prétraitement de biopsie de CNE humain Nasale gratter biopsie Obtenir EC superfi…

Representative Results

CNE cultivée en suivant le protocole décrit ici re-différencier en une couche hétérogène de EC composé de cellules ciliées et non ciliées, représentant la situation in vivo (Figure 1). Certains des CNE sont différenciées mucus de production (cellules colorées en bleu en utilisant AB / PAS, figure 1B). Même si le protocole présenté ici est optimisée, la différenciation peut varier en ce qui concerne la distribution des populations de cellules totales (c&#39…

Discussion

EC respiratoires fournissent non seulement une barrière physique pour protéger le corps humain de stimuli exogènes ^20, mais aussi agir comme un standard pour initier et réguler les réponses respiratoires de défense immunitaire ^1-3 via la sécrétion de médiateurs solubles ou des interactions cellule-cellule récepteur-ligand directs. Afin d'étudier le rôle des EC dans la réponse immunitaire, pour examiner les différences potentielles entre les EC des populations malades, ou pour étu…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Nasal speculum	Welch Allyn	Model 22009	9 mm, reusable polyproylene
Operating otoscope	Welch Allyn	Model 21700
Rhino probe cell cuvette	Arlington Scientific	SY-96-092	bend the head of the cuvette a little more
12-well culture plates	Corning	3512
Transwell membrane cell culture inserts	Corning	3460
Tissue culture flask	Corning	430639 and 430641	T25 and T75 vented flask
RPMI 1640 media (with L-Glutamine)	Gibco	11875
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium	Cell applications	511-500
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3170	This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution	Gibco	25080	Use as it is.
NuSerum	BD Biosciences	355104	Use as it is.
BAMBANKER freezing media	BAMBANKER	302-14681	Use as it is.
CoolCell	Biocision	HTBCS-136	(CryoPrep alcohol-free cell freezing container)
PureCol	AdvancedBioMatrix	5005-B	dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate
HBSS with Ca2 and Mg2+	Gibco	14025
DNAse 1	Sigma	DN25	Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red	Gibco	25200-056	Use at it is
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI)	Sigma	T6522	Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml
Retinoic acid	Sigma	R7632	Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate	Gibco	11995
Bovine Pituitary Extract	Gibco	13028-014	Used for BEGM ALI media.
Nystatin	Sigma	N4014-50 mg	Make up a solution of 3.3 mg/ml.
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100	Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.
PneumaCult-ALI media	StemCell	5001	This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.
Hydrocortisone	StemCell	7904	Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml)	StemCell	7980	Use at it is.
Filter flasks (500 ml)	Corning	431097	0.22 μm pore size
Filter tubes (50 ml)	Millipore	SCGP00525	Steriflip, 0.22 μm pore size
Pipette tips – ART Barrier Tips	Molecular Bioproducts	2139RI, 2069RI, 2179RI
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml
ddH2O, absolute ethanol, ice
CO2 incubator
refrigerated centrifuge
biological safety cabinet
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes
gloves
lab coat with tight cuffs
			Media and solutions used: Recipe Used for General remark: always warm the media to room temperature BEGM media 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid (mix them half-half and filter ) 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements digestion of the biopsy BEGM+ media 50 ml BEGM media maintaining cells on plastic in the plates (passage0) 10 μl retinoic acid (working solution) seeding cells in the flask (passage1; partially) maintain the cells in the flask BEGM++ media 50 ml Lonza’s BEGM media with supplements seeding fresh cells in 12-well plate on plastic 1 ml Sodium BiCarb maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially) 2.5 ml NuSerum seeding cells in the flask (passage1; partially) BEGM ALI media 250 ml DMEM-H Maintaining cells on the transwell before they go ALI 250 ml BEGM including supplements 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution) 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution) 75 μl BSA (10 mg/ml solution) 200X Hydrocortisone Stock Solution (96 μl/ml solution) 200 μl dissolved hydrocortisone As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts 4250 μl dissolved sodium chloride 540 μl ddH2O 10 μl absolute ethanol Filter solution through 0.22 μm filter, aliquot solution and store at -20 °C, avoid additional freeze/thaw cycles PneumaCult-ALI Complete Base Media 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium Base medium for all three PneumaCult-ALI media 50 ml PneumaCult 10x Supplement The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark (this is stable for 2 weeks at 2-8 °C or for up to 6 months at -20 °C) PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI culture on inserts 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement 2 μl Heparin (of a 2 mg/ml stock solution) 5 μl Hydrocortisone (of a 96 μl/ml stock solution)