Odling av Human Nasal epitelceller på Air Liquid Interface

Summary

Nasala epitelceller, som erhållits genom ytliga skrap biopsi av frivilliga försökspersoner, expanderas och överförs till vävnadskulturinsatser. Vid ankomsten till konfluens odlas celler vid luft flytande gränssnitt, vilket ger kulturer av cilierade och icke-cilierade celler. Differentierade nasala epitelceller cellkulturer ger livskraftiga experimentella modeller för att studera luftvägarna slemhinna.

Abstract

In vitro-modeller med humana primära epitelceller är väsentliga för att förstå viktiga funktioner av respiratoriska epitelet i samband med mikrobiella infektioner eller inhalerade medel. Direkta jämförelser av celler från sjuka populationer tillåter oss att karakterisera olika fenotyper och dissekera de bakomliggande mekanismerna som förmedlar förändringar i epitelceller funktion. Odling epitelceller från human tracheobronchial regionen är väl dokumenterad, men begränsas av tillgången på lungvävnad eller humant invasivt i samband med att få bronkerna borstar biopsier. Nasala epitelceller erhålls genom mycket mindre invasiva ytliga nasal skrapa biopsier och ämnen kan biopsier flera gånger utan några signifikanta biverkningar. Dessutom är näsan inkörsport för luftvägarna och därmed en av de första platserna att utsättas för någon form av luftburna stressfaktor, t.ex. mikrobiella medel, föroreningar eller allergener.

I korthet är nasala epitelceller som erhållits från frivilliga människor expanderat på belagda vävnadsodlingsplattor, och sedan överförs till cellkulturinsatser. Vid ankomsten till konfluens, celler fortsätter att odlas på luft-vätske-gränssnitt (ALI), i flera veckor, vilket skapar mer fysiologiskt relevanta förhållanden. Den ALI kultur villkoret använder definierade medier leder till en differentierad epitel som uppvisar morfologiska och funktionella egenskaper som liknar den mänskliga nässlemhinnan, med både cilie och slemproducerande celler. Vävnadsodlings skär med differentierade nasala epitelceller kan manipuleras i en mängd olika sätt beroende på forskningsfrågor (behandling med farmakologiska medel, transduktion med Lentiviral vektorer, exponering för gaser eller infektion med mikrobiella medel) och analyserades för många olika slutpunkter som sträcker sig från cellulära och molekylära vägar, funktionell lmAnges, morfologi etc.

In vitro-modeller av differentierade humana nasala epitelceller kommer att göra det möjligt för utredarna att ta itu med nya och viktiga forskningsfrågor med hjälp organotypic experimentella modeller som i stor utsträckning efterlikna nässlemhinnan in vivo.

Introduction

Mål av tekniken

Epitelceller (ECS) i luftvägarna är bland de första platserna som direkt utsatta för inhalerade miljöpåverkande faktorer, såsom patogener, allergener och luftföroreningar. EC är mer än ett strukturellt hinder: De fungerar som en växel för att initiera och reglera luftvägarna immunsvar ^1-3 via frisättningen av lösliga mediatorer ^4-6 och uttrycket av ligander / receptorer på sin yt ^7-9. Medan odödliga cellinjer kan användas som modeller för att studera andnings EC in vitro, misslyckas de att differentieras till heterogena cellpopulationer som består av polariserad cilierade och slemproducerande celler, liknande det som observerats in vivo. För att sammanfatta viktiga egenskaper hos det respiratoriska epitelet observerats in vivo, kan primära luftvägs EC användas. Därför är vårt mål var att optimera vår metod utnyttjar nasal EC (NEC) som erhållits från frivilliga. The NEC expanderas och odlas in vitro, vilket gav en cellkulturmodell för differentierade NEC som härmar många av funktionerna i det nasala epitelet ses in vivo.

Bakgrund

Användningen av in vitro-modeller med humana primära EC härma in vivo-situation – som beskrivs i denna studie – ger unika möjligheter att studera sjukdomsspecifika skillnader i EC, fysiologiska parametrar i samband med luftvägsslemhinnan, eller växelverkan mellan EC och andra celltyper, såsom dendritiska celler ^10, naturliga mördarceller ¹¹ eller makrofager. Flera befintliga metoder utnyttjar luftrörs EC, som kan erhållas invasivt via borst biopsier under bronchoscopies, eller från något annat kasslungvävnad ^12-17. Dessutom kommersiella källor för att få fullt differentierade mänskliga luftvägarna epitelial cellkulturer existerar (EpiAirway modell från Mattek, Ashland, MA, Cloneticsfrån Lonza, Basel, Schweiz, MucilAir från Epithelix Sars, Genève Schweiz), där utredarna kan välja mellan olika givare. Men på grund av den begränsade pool av kommersiellt tillgängliga epitelceller, begränsade eller föreskriven uppsättning parametrar, kostnaden i samband med kommersiellt erhålla primära humana luftvägar EC, och den begränsade tillgången till kasselungvävnad eller nyligen erhållna human bronkial biopsivävnad, förbjuda många utredare från studier på fullt differentierade mänskliga luftvägs EC. Därför har vi på att utveckla en teknik som kommer att 1) ​​använda icke-invasivt erhållna humana NEC, 2) ge ett protokoll som ger kulturer av differentierad mänsklig luftvägsepitel, och 3) vara reproducerbar i de flesta lab inställningar med en befintlig vävnadskultur infrastruktur.

Fördelar jämfört med existerande tekniker / modeller

Erhållande färska NEC, jämfört med bronkial eller små luftvägar EC, är mycket mindre invasiva, individuells kan biopsier flera gånger utan några betydande biverkningar, och ytliga nasala skrap biopsier kan utföras på sjuka populationer som annars inte skulle vara kvalificerade för forskningsrelaterade bronchoscopies. Icke-invasiv ytliga skrap biopsier att få NEC tillåter forskaren att ställa donator specifikation a priori, inklusive ålder, kön, sjukdomsstatus, etc. i enlighet med forsknings mål som skall uppnås. Alltså, när man utformar forskningsstudier utredare inte begränsas av kliniskt tillgängliga vävnader / epiteliala prov, köpa dyra differentierade cellkulturmodeller från kommersiella leverantörer, eller design invasiva bronkoskopi studier. Dessutom den lätthet att erhålla NEC ökar förmågan att genomföra experiment i celler från olika givare, vilket förbättrar statistisk validering av observerade undersökningsresultat. Slutligen är näsan en av de första platserna att utsättas för någon form av luftburna stressfaktorer. Således genere organotypisk iodlings vitro-system som härmar det nasala epitelet är användbara för att studera inandning av virala partiklar, föroreningar, allergener, eller gaser, som lätt kan uppnås genom användning av denna cellkultursystem.

Protocol

1. Förbered Plast Ware: Coat Plate Addera 500 pl PureCol (1:100 spädd med sterilt vatten) till varje brunn i en 12-brunnars platta. Inkubera vid 37 ° C i en inkubator i 30 minuter, ta bort PureCol och skölj med HBSS precis innan cellerna tillsätts till plattan (se steg 3.1). 2. Att få och förbehandla Biopsi av Human NEC Nasal scrape biopsi Skaffa ytliga EC kantar nasala näsmusslan under direkt vision genom en 9 mm återanvändningsbar po…

Representative Results

NEC odlade efter det här beskrivna protokollet åter differentiera till en heterogen lager av EC består av cilierade och icke-cilierade celler, som representerar in vivo-situationen (figur 1). Några av de differentierade NEC är slem som producerar (celler färgning i blått med hjälp av AB / PAS, Figur 1B). Även om den här presenterade protokollet optimeras, kan differentiering variera med avseende på fördelningen av de totala cellpopulationer (dvs. olika för…

Discussion

Andnings EC ger inte bara en fysisk barriär för att skydda kroppen från exogena stimuli ^20, men också fungera som en växel för att initiera och reglera andnings immunförsvar svar ^1-3 via utsöndring av lösliga mediatorer eller direkta receptor-ligand-cell-cell interaktioner. För att ytterligare studera betydelsen av EC i immunsvaret, för att undersöka eventuella skillnader mellan EC från sjuka populationer, eller för att studera effekterna av exogena faktorer på EC, är det viktigt at…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Nasal speculum	Welch Allyn	Model 22009	9 mm, reusable polyproylene
Operating otoscope	Welch Allyn	Model 21700
Rhino probe cell cuvette	Arlington Scientific	SY-96-092	bend the head of the cuvette a little more
12-well culture plates	Corning	3512
Transwell membrane cell culture inserts	Corning	3460
Tissue culture flask	Corning	430639 and 430641	T25 and T75 vented flask
RPMI 1640 media (with L-Glutamine)	Gibco	11875
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium	Cell applications	511-500
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3170	This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution	Gibco	25080	Use as it is.
NuSerum	BD Biosciences	355104	Use as it is.
BAMBANKER freezing media	BAMBANKER	302-14681	Use as it is.
CoolCell	Biocision	HTBCS-136	(CryoPrep alcohol-free cell freezing container)
PureCol	AdvancedBioMatrix	5005-B	dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate
HBSS with Ca2 and Mg2+	Gibco	14025
DNAse 1	Sigma	DN25	Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red	Gibco	25200-056	Use at it is
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI)	Sigma	T6522	Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml
Retinoic acid	Sigma	R7632	Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate	Gibco	11995
Bovine Pituitary Extract	Gibco	13028-014	Used for BEGM ALI media.
Nystatin	Sigma	N4014-50 mg	Make up a solution of 3.3 mg/ml.
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100	Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.
PneumaCult-ALI media	StemCell	5001	This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.
Hydrocortisone	StemCell	7904	Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml)	StemCell	7980	Use at it is.
Filter flasks (500 ml)	Corning	431097	0.22 μm pore size
Filter tubes (50 ml)	Millipore	SCGP00525	Steriflip, 0.22 μm pore size
Pipette tips – ART Barrier Tips	Molecular Bioproducts	2139RI, 2069RI, 2179RI
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml
ddH2O, absolute ethanol, ice
CO2 incubator
refrigerated centrifuge
biological safety cabinet
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes
gloves
lab coat with tight cuffs
			Media and solutions used: Recipe Used for General remark: always warm the media to room temperature BEGM media 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid (mix them half-half and filter ) 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements digestion of the biopsy BEGM+ media 50 ml BEGM media maintaining cells on plastic in the plates (passage0) 10 μl retinoic acid (working solution) seeding cells in the flask (passage1; partially) maintain the cells in the flask BEGM++ media 50 ml Lonza’s BEGM media with supplements seeding fresh cells in 12-well plate on plastic 1 ml Sodium BiCarb maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially) 2.5 ml NuSerum seeding cells in the flask (passage1; partially) BEGM ALI media 250 ml DMEM-H Maintaining cells on the transwell before they go ALI 250 ml BEGM including supplements 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution) 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution) 75 μl BSA (10 mg/ml solution) 200X Hydrocortisone Stock Solution (96 μl/ml solution) 200 μl dissolved hydrocortisone As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts 4250 μl dissolved sodium chloride 540 μl ddH2O 10 μl absolute ethanol Filter solution through 0.22 μm filter, aliquot solution and store at -20 °C, avoid additional freeze/thaw cycles PneumaCult-ALI Complete Base Media 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium Base medium for all three PneumaCult-ALI media 50 ml PneumaCult 10x Supplement The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark (this is stable for 2 weeks at 2-8 °C or for up to 6 months at -20 °C) PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI culture on inserts 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement 2 μl Heparin (of a 2 mg/ml stock solution) 5 μl Hydrocortisone (of a 96 μl/ml stock solution)