एसटीए डाल वेग अवसादन का प्रयोग Spermatogenic प्रकार की कोशिकाओं का पृथक्करण
Summary
एसटीए डाल विधि आकार और घनत्व के आधार पर spermatogenic कोशिकाओं के विभिन्न आबादी के अलग होने के लिए अनुमति देता है.
Abstract
स्तनधारी शुक्राणुजनन वृषण के बीजदार tubules में कई चरणों में होता है कि एक जटिल भेदभाव प्रक्रिया है. वर्तमान में, वहाँ के लिए इन विट्रो में spermatogenic भेदभाव की अनुमति के लिए कोई विश्वसनीय सेल संस्कृति प्रणाली है, और spermatogenic कोशिकाओं की सबसे जैविक पढ़ाई माउस और चूहे की तरह पशु मॉडल से ऊतक फसल की आवश्यकता होती है. गैर spermatogenic (Leydig, Sertoli, माइलॉयड, और उपकला कोशिकाओं) और spermatogenic दोनों (spermatogonia, spermatocytes, गोल spermatids, spermatids और शुक्राणु संघनक) – – वृषण कई प्रकार की कोशिकाओं क्योंकि इसमें शुक्राणुजनन में शामिल जैविक तंत्र के अध्ययन के अलगाव की आवश्यकता और इन विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के संवर्धन. इस मामले में, वृषण – से – एक रेखीय बीएसए ढाल के माध्यम से एसटीए डाल विधि कोशिकाओं की एक विषम आबादी के अलग होने के लिए अनुमति देता है. व्यक्तिगत सेल प्रकार CE के अनुसार अलग अवसादन वेग के साथ तलछटएल एल आकार, और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए समृद्ध भिन्न एकत्र की है और आगे के विश्लेषण में उपयोग किया जा सकता है. एसटीए डाल विधि निश्चित सेल छँटाई तरीकों के साथ प्राप्त किया जा सकता है उदाहरण के रूप में सेल प्रकार की अत्यधिक शुद्ध भिन्न, में परिणाम नहीं करता है, यह प्रत्येक अंश में कुल कोशिकाओं का एक बहुत उच्च उपज प्रदान करता है
(7-8 एक्स 10 8 कोशिकाओं का एक प्रारंभिक आबादी से ~ 1 x 10 8 कोशिकाओं / spermatogenic सेल प्रकार). इस उच्च उपज पद्धति केवल विशेष कांच के बने पदार्थ की आवश्यकता है और यह एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर (FACS) या elutriator जैसे विशेष उपकरणों के लिए सीमित उपयोग किया है कि प्रयोगशालाओं के लिए एक आदर्श तरीका है, जिससे किसी भी ठंडे कमरे या बड़े फ्रिज में प्रदर्शन किया जा सकता है.
Introduction
स्तनधारी शुक्राणुजनन वृषण 1 के बीजदार tubules में कई चरणों में होता है कि एक जटिल भेदभाव प्रक्रिया है. संक्षेप में, बीजदार छोटी नली विभाजन की उपकला के पास रहते हैं कि spermatogonia तरह स्टेम और फिर meiotic डिवीजनों से गुजरना जो spermatocytes, में अंतर. अर्धसूत्रीविभाजन बाद पूरा हो गया है, जिसके परिणामस्वरूप अगुणित कोशिकाओं, या दौर spermatids, spermiogenesis, cytoplasm और नाभिक के संघनन से बहा शामिल है कि एक भेदभाव प्रक्रिया से गुजरना. Spermatids धीरे – धीरे क्रमशः, एक कशाभिका विकसित और नाभिक के बढ़ाव और संक्षेपण गुजरना, elongating और फिर संघनक spermatids का निर्माण किया. अंत उत्पादों बीजदार छोटी नली और अंततः वे आगे परिपक्व जहां अधिवृषण में की लुमेन में जारी किया जाता है जो शुक्राणु, कर रहे हैं.
शुक्राणुजनन की प्रक्रिया में विशेष हार्मोनल और आणविक स्थितियों पर निर्भर करता है क्योंकिवृषण, शुक्राणुजनन की पूरी प्रक्रिया के लिए एक विश्वसनीय में इन विट्रो संस्कृति प्रणाली अभी तक 2,3 विकसित नहीं किया गया है. संस्कृति तरीकों स्टेम सेल से "मौलिक रोगाणु सेल कोशिकाओं की तरह" और अगुणित, "दौर spermatid कोशिकाओं की तरह" बनाने के लिए विकसित किया गया है, लेकिन इन तरीकों अभी तक इन कोशिकाओं की बड़ी संख्या पैदा करते हैं और बाद में spermatogenic सेल का उत्पादन करने में विफल करने में सक्षम नहीं हैं प्रकार 4,5. सौभाग्य से, spermatogenic प्रकार की कोशिकाओं के एक तरल ढाल के साथ अलग होने की पूरी वृषण से प्राप्त एक एकल कक्ष निलंबन के लिए अनुमति देता है, जो आकार में काफी मतभेद है. एसटीए डाल विधि, यहाँ का प्रदर्शन, आकार और द्रव्यमान 6-9 पर आधारित spermatogenic कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक रेखीय बीएसए ढाल और सरल अवसादन का उपयोग करता है.
FACS और धावन 10-13: एसटीए डाल विधि spermatogenic प्रकार की कोशिकाओं को अलग करने के लिए अन्य दो सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल के तरीकों पर कई फायदे हैं. एसटीए डाल तंत्र onl आवश्यकताविशेष कांच के बने पदार्थ के y कई टुकड़े एक ठंडे कमरे या बड़े फ्रिज में इकट्ठे हुए. इस प्रकार, यह एक सेल सॉर्टर या एक elutriator उपयोग करने की तुलना में कम खर्चीला है. प्रत्येक सेल आबादी की पवित्रता FACS 11 के साथ प्राप्त उन लोगों के रूप में अधिक नहीं है, हालांकि एसटीए डाल विधि, सेल प्रकार और एक तुलनीय समय सीमा में FACS द्वारा हल किया जा सकता से वृषण प्रति कोशिकाओं की उच्च मात्रा में पैदावार. सेल (चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई, एमएसीएस) ने हाल ही में सफलतापूर्वक एक मिश्रित वृषण सेल की आबादी से spermatogonia के संवर्धन के लिए नियोजित किया गया है, लेकिन यह 14 मार्करों उपयुक्त सतह के ज्ञान की कमी के कारण spermatocytes या spermatids को अलग करने के लिए वर्तमान में अनुपयुक्त है चुंबकीय मोतियों का उपयोग छँटाई. FACS या एमएसीएस अधिक एसटीए डाल विधि का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि सबसे FACS प्रोटोकॉल के विपरीत, यह किसी भी डीएनए या धुंधला अन्य प्रकार की आवश्यकता नहीं है, क्योंकि बाद में संस्कृति के लिए उपयुक्त व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता है. एल की आवश्यकता है कि पढ़ाई के लिएspermatogenic कक्षों प्रकार की arge पैदावार ~ 90% शुद्धता पर, एसटीए डाल एक आदर्श तरीका है.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक विश्वसनीय सेल संस्कृति प्रणाली अभी तक सभी spermatogenic प्रकार की कोशिकाओं 3 पैदा करने के लिए मौजूद नहीं है के रूप में शुक्राणुजनन अध्ययन जो लोग spermatogenic सेल के नमूने के लिए पशु मॉडल पर भरोसा करते हैं. Spermatogenic क?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध एनआईएच अनुदान SLB को GM055360 और RGM को U54HD068157 द्वारा समर्थित किया गया. JMB पेन्सिलवेनिया विश्वविद्यालय (GM008216) में T32 जेनेटिक्स प्रशिक्षण अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternate can be used. |
| 0.5%, 2%, and 4% BSA solutions | Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| KREBS (10x) | 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 | Autoclave/filter and store at 4 °C for several months. | |
| KREBS (1x) | Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| Collagenase | Sigma | C9891-1G | |
| DNAse | Sigma | DNEP-5MG | |
| Trypsin | Sigma | T9201-1G | |
| DAPI | Preference of researcher | ||
| Triton-X100 | Preference of researcher | ||
| Formaldehyde (~37%) | Preference of researcher | ||
| TABLE 2: EQUIPMENT | |||
| Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Complete STA-PUT apparatus | ProScience Glass Shop | STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) | Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers. |
| 10 μm mesh filter | Fisherbrand | 22363549 | |
| Mouse dissection tools | Preference of researcher | ||
| 14 ml round bottom fraction collection tubes with caps | Preference of researcher | ||
| Need approximately 100 tubes | |||
| Fraction collector | GE Healthcare Life Sciences | Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 | Alternate can be used. |
| Microscope slides, cover glass | Preference of researcher | ||
| Light/Fluorescent Microscope | Preference of researcher | ||
References
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