Att skapa experimentella retinal detachement med en reproducerbar och ihållande höjd av avskildhet och utan subretinal blödning, är viktig för att studera patofysiologin vid fotoreceptorcellförlust i näthinnesjukdom och utvärdera potentiella terapeutiska ingrepp. Här rapporterar vi en sådan metod i detalj.
Subretinal injektion av natriumhyaluronat är en allmänt accepterad metod för att inducera näthinneavlossning (RD). Däremot kan höjden och längden på RD eller förekomsten av subretinal blödning påverkar fotoreceptor celldöd i näthinneavlossning. Därför är det fördelaktigt att skapa reproducerbara RDar utan subretinal blödning för bedömning av fotoreceptor celldöd. Vi ändrade en tidigare rapporterad metod för att skapa bullös och ihållande RDar på ett reproducerbart läge med sällsynta förekomsten av subretinal blödning. Det kritiska steget i denna modifierade metoden är att skapa en självtätande scleral snitt, vilket kan förhindra läckage av natriumhyaluronat efter injektion i subretinal rymden. För att göra det självtätande sklerala snittet, en skleral tunnel skapas, följt av skleral inträngning i åderhinnan med en 30 G nål. Även om koroidala blödning kan inträffa under detta steg, astriction med ett kirurgiskt spjut minskar graden av koroidal fållorrhage. Denna metod tillåter en mer reproducerbar och tillförlitlig modell för fotoreceptor död i sjukdomar som involverar RD såsom regmatogen RD, prematur retinopati, diabetisk retinopati, central serös chorioretinopathy, och åldersrelaterad makuladegeneration (AMD).
Fotoreceptor celldöd och efterföljande visuell minskning inträffar när fotoreceptorerna är separerade från det underliggande pigmentepitelet. Fysisk separation av fotoreceptorer ses i olika näthinnesjukdom, inklusive åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), central serös chorioretinopathy, diabetesretinopati, och retinopati hos prematura, liksom regmatogen (dvs. som orsakas av ett avbrott i näthinnan) näthinneavlossning ( RD). Subretinal injicering av natriumhyaluronat är en allmänt accepterad modell för att skapa en RD som leder till ljusmätare celldöd, som ger insikt i patofysiologin av ljusmätare degeneration 1-15.
Ljusmätare degeneration inducerad av subretinal natriumhyaluronat injektion, först introducerades 2001 7, har den fördelen att en rimlig tid kurs (dagar till veckor). Den kan emellertid ha betydande variabilitet fotoreceptorcellförlust från djur till animal på grund av två viktiga faktorer som påverkar ljusmätare celldöd efter RD: 1) höjd och varaktighet RD, och 2) Förekomsten av subretinal blödning. Det finns en brant inlärningskurva för den metod som bidrar till att båda faktorerna teknisk. Fotoreceptor cell degeneration ökar med höjden på RD, som avståndet mellan näthinnans pigmentepitel (RPE)-skiktet och fotoreceptorer ökar från 16 till 17. I överensstämmelse med dessa rapporter, våra tidigare experiment visade mer ljusmätare död i bullösa RDar än grunda RD. Det har också rapporterats att subretinal blödning är giftigt för fotoreceptorceller och påverkar ljusmätare celldöd 18-21. Likaså har vi observerat mer ljusmätare död i RDar med subretinal blödning än RDar utan subretinal blödning. Därför tekniker för att minimera variabiliteten måste fokusera på att uppnå konsekventa höjder RD samtidigt undvika subretinal blödning.
Vårt modifierade metoden enligt iducera RD kan göra reproducerbar bullös och ihållande RD på samma position i ögat med sällsynta förekomsten av subretinal blödning. Vi utförde operationen med hjälp av en tidsmässig strategi eftersom det är lättare att uppnå en bredare operativa området jämfört med andra platser. Efter konjunktival snitt, är en självtätande skleral incision med användning av en 30 G nål. En skleral tunnel skapas, följt av skleral inträngning i åderhinnan. Om choroidal blödning uppstår i detta steg kommer blödning ur ögat genom skleral såret, och blödningen kan stoppas genom astriction med en kirurgisk spjut. En främre kammaren punktering utförs sedan från hornhinnan för att minska det intraokulära trycket. Detta är ett viktigt steg eftersom subretinal injektion enbart kommer att leda till ökat intraokulärt tryck med resulte retinal artär ocklusion och ischemi i det inre näthinnan. A 33 G nål förbunden med en il spruta Hamilton 10 förs sedan in i det subretinala utrymmet, och 3,5 μ, L natriumhyaluronat försiktigt injiceras för att lossa den neurosensoriska näthinnan från den underliggande RPE. I motsats till andra metoder för att inducera RD som utförs under fundus observation är denna teknik utföras under direkt observation. Sedan den sklerala sår är självtätande, kommer natriumhyaluronat inte att läcka ut efter injektion. Slutligen är lim pålagt den sklerala sår, och bindhinnan är anbringas på nytt till sin ursprungliga position. Dessa varar åtgärder minskar också risken för natriumhyaluronat läckage. Injektionen av 3,5 pl natriumhyaluronat skapar reproducerbara RDS (50% av näthinnan) i ögonen på 8 veckor gamla möss. Att skapa det självtätande sår är det viktigaste steget i vår modifierade förfarande eftersom det hindrar den injicerade natriumhyaluronat från att läcka ut ur ögat, vilket möjliggör reproducerbar bullös och ihållande RDS.
Flera metoder för att fastställa en RD-modell i gnagare ögon har rapporterats 3-15, 22. De flesta av dem använder subretinal injicering av natriumhyaluronat, eftersom det är en trögflytande material som vanligen används vid intraokulär kirurgi hos människor, och det är inte förknippat med någon känd okulär toxicitet 1-15. Natriumhyaluronat, snarare än fysiologisk koksaltlösning eller fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS), ökar varaktigheten av RD.
Metoderna för subretinal injicering av natriumhyaluronat använda en av två metoder: en transvitreal metod 3-6 eller en transscleral strategi 7-15. Båda förfarandena utförs med observation av fundus. I transvitreal tillvägagångssätt används en subretinal injektom förs in i glaskroppsrummet en retinotomy skapas i den perifera näthinnan, och natriumhyaluronat injiceras i det subretinala utrymmet. I denna metod är två retinal tårar gjorts, vilket ökar risken för näthinnanl blödning som kan gå in i subretinal rymden. Dessutom finns det en risk för att linsskada när retinotomy skapas. Det finns flera modifierade metoder för transscleral tillvägagångssätt. I de flesta av dessa metoder 7-12, efter att minska det intraokulära trycket med en främre kammare punktera en 30 G nål förbunden med en spruta fylld med natriumhyaluronat är direkt införd i det subretinala utrymmet genom bindhinnan, senhinnan, koroidea, och RPE. Den natriumhyaluronat sprutas sedan in i det subretinala utrymmet. Risken för näthinneruptur och linsskada använder denna transscleral metoden är mindre än det som använder den transvitreal tillvägagångssätt. Emellertid är det hål som gjorts i sklera genom en 30 G nål stor, särskilt för mus ögon och natriumhyaluronat injiceras i det subretinala utrymmet läcker lätt ut ur ögat genom den sklerala sår. Detta leder till en lägre, mindre ihållande RD och mer variabel död fotoreceptorcell. Dessutom, om choroidal blödning uppstår iden sklerala perforering steg kommer hemorragi spridas i subretinal utrymme eftersom det intraokulära trycket har reducerats före subretinal hyaluronat injektion.
Flera faktorer kan påverka effekten av RD på näthinneavlossning, både subretinal blödning och höjden och ihållande RD 16-21. Fotoreceptorcelldöd ökar med ökande höjd av RD 16, 17 och fotoreceptorcellskada kan vara mer omfattande på grund av minskad diffusion av syre och näringsämnen från choriocapillaris med högre RD jämfört med grunt RD. Subretinal blödning är också giftigt för fotoreceptorceller 18-21, möjliga mekanismer för denna toxicitet i näthinneavlossning inkluderar hypoxi och metabola störningar av subretinal blödning som en diffusionsbarriär, och direkt neurotoxicitet inducerad av blodkomponenter (t.ex. järn). Lins skada, som har rapporterats att ha en skyddande effekt på retinella ganglieceller 23, kan också påverka fotoreceptorcelldöd efter induktion av RD. Dessutom, om posten sårområdet inte förslutits kan natriumhyaluronat läcka ut med ögon manipulation under enucleation. Detta kan leda till en felaktig klassificering av en RD så grunt, vilket i sin tur kan påverka tolkningen av resultaten.
Vi ändrade transscleral metod för subretinal injicering av natriumhyaluronat att öka reproducerbarheten av RDS och minska graden av subretinal blödning. Det kritiska steget i detta protokoll är att skapa en självtätande scleral snitt med hjälp av en 30 G nål, vilket förhindrar läckage av natriumhyaluronat efter injektion. Till skillnad från tidigare metoder, är detta protokoll utförs utan observation av fundus så större uppmärksamhet ägnas åt den skleralt såret. Applicering av lim förhindrar även natriumhyaluronat från att läcka ut ur ögat. I vår erfarenhet, graden av subretinal blödning med detta protokoll wsom signifikant mindre än den med andra protokoll. Om koroidal blödning inträffar under den sklerala snittet steg, kommer det att lämna ögat genom den sklerala sår eftersom detta steg utförs innan minska intraokulärt tryck. Om koroidal blödning uppstår efter sänkning av det intraokulära trycket och avlossning av neurosensoriska näthinnan, kommer blod dissekera i subretinal rymden. Vi fann att detta ska ske i cirka 5% av fallen i motsats till ca 10-20% med andra tekniker. Dessa djur bör undantas från analysen.
Denna teknik kan också användas för subretinal injektion av vektormedierad genöverföring till mål fotoreceptor-eller RPE-celler 24, 25. Eftersom den typiska vehikel (PBS, saltlösning) för dessa injektioner är betydligt mindre viskös än natriumhyaluronat är standardtekniker som plågas av flera läckor. Den teknik som beskrivs häri, genom att minska denna risk, gör vektoröverföringsförsök mer reproducerbar ochtillförlitliga.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Wendy Chao för hennes stöd i kritisk granskning. Detta arbete stöddes av Bausch & Lomb vitreoretinala Fellowship (HM), National Eye Institute bidrag EY014104 (JWM), forskning för att förebygga blindhet Foundation (DGV), Lions Eye Research Fund (GD V), samt en generös donation av Yeatts familjen (JWM och GD V).
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Ketaject | Phoenix | 2010025 | |
AnaSed | LLOYD | 4004821 | |
5% Phenylephrine / 0.5% Tropicamide | Massachusetts Eye and Ear Pharmacy | ||
0.5% Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution | AKORN | 17478-263-12 | |
Provics | Alcon | 8065183085 | |
Webglue | Patterson Veterinary | 07-8566128 | |
Microscope | Leica | MG90 | |
30G1/2 PrecisionGlide Needle | BD | 305106 | |
Weck-Cel Eye Spears | Beaver-Visitec | 0008685 | |
10 Microliter Syringe | Hamilton | 7635-01 | |
33 gauge, 0.5 inch needle | Hamilton | 7803-05 | |
18x18mm Cover Glass | Fisher Scientific | 18-548A |