Génération de Arenavirus recombinant pour le développement de vaccins approuvés par la FDA des cellules Vero

Summary

Sauvetage d'arénavirus recombinantes à partir des ADNc clonés, une approche appelée génétique inverse, permet aux chercheurs d'étudier le rôle des produits spécifiques de gènes viraux, ainsi que la contribution de leurs différents domaines et les résidus spécifiques, à différents aspects de la biologie des arénavirus . De même, les techniques de génétique inverse dans les lignées cellulaires approuvé par la FDA (Vero) pour le développement d'un vaccin fournit de nouvelles possibilités pour la production de vaccins sûrs et efficaces pour lutter contre les arénavirus pathogènes pour l'homme.

Abstract

L'élaboration et la mise en œuvre des arénavirus génétique inverse représente une percée importante dans le domaine arénavirus ^4. L'utilisation de systèmes de minigénome arénavirus à base de cellules ainsi que la capacité à générer des arénavirus infectieuses recombinantes présentant des mutations prédéterminées dans leurs génomes a facilité l'enquête de la contribution des déterminants viraux aux différentes étapes du cycle de vie d'un arénavirus, ainsi que des virus-hôte interactions et les mécanismes de pathogénie arénavirus ^{1, 3, 11.} En outre, le développement des arénavirus trisegmented a permis l'utilisation du génome arénavirus à exprimer des gènes étrangers d'intérêt supplémentaires, ouvrant ainsi la possibilité d'applications de vecteurs vaccinaux arénavirus à base ^5. De même, le développement des arénavirus infectieuses cycle unique capables de gènes rapporteurs exprimant fournit un nouvel outil expérimental pour améliorer la sécurité de la recherche impliquant highly pathogènes humains arénavirus ^16. La génération des arénavirus recombinantes utilisant des techniques de génétique inverse à base de plasmides a reposé jusqu'à présent sur ​​l'utilisation des lignées de cellules de rongeurs ^7,19, ce qui pose certains obstacles pour le développement de la Food and Drug Administration (FDA) sous licence vaccin ou vecteurs vaccinaux. Pour surmonter cet obstacle, nous décrivons ici la génération efficace de arénavirus recombinants dans les cellules Vero approuvé par la FDA.

Introduction

Arénavirus sont des virus enveloppés avec un bisegmented, génome à ARN brin négatif ³ qui appartiennent à la famille Arenaviridae. Le génome du code arénavirus quatre protéines dans un mode de ambisens de deux segments distincts virales ^3. Le grand segment (L) code l'ARN polymérase ARN-dépendante (L) et la petite ceinture (Really Interesting New Gene) de protéine à doigt (Z) qui sert de principale force motrice de bourgeonnement du virus. Le petit segment (S) codant pour la nucléoprotéine virale (NP) et la glycoprotéine de surface (GP) (Figure 1).

Plusieurs membres de la famille Arenaviridae sont responsables de la fièvre hémorragique mortelle (HF) chez l'homme ^3. Principe préoccupations virus Lassa (LASV) et le virus Junin (JUNV), qui sont connus pour causer une forte mortalité chez les patients hospitalisés ^{8, 9.} Bien que ces virus sont endémiques à l'Afrique de l'Ouest et l'Argentine rurale, respectivement,il ya des préoccupations croissantes en matière d'importation de LASV et JUNV vers des zones non endémiques en raison de l'augmentation des voyages ^10. En outre, bien que n'étant pas normalement associée à une maladie grave chez l'homme, l'arénavirus prototype du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV) est considéré comme un pathogène négligé car il ya eu des cas d'infection mortelle chez les patients immunodéprimés ^{6, 15} et est responsable de malformations congénitales et des avortements spontanés chez les femmes enceintes ^{2, 13.} Actuellement il n'ya pas approuvés par la FDA américaine vaccins contre arénavirus et le traitement se limite à l'analogue nucléosidique ribavirine, qui n'est que partiellement efficace et souvent associé à des effets secondaires importants.

L'introduction d'inverse à base de plasmides génétique ⁴ et génération de arénavirus recombinantes ^{7, 19} ont grandement fait progresser le domaine de la recherche sur arénavirus. Actuellement, les cellules de rongeurs (comme BHK-21) sont utilisés pour la généation des arénavirus recombinantes en raison de l'ARN polymérase I murine spécifique à l'espèce (pol-I) promoteur diriger la transcription initiale de la S et L segments. Cependant sauvetage du virus dans les cellules BHK-21 ne sont pas une méthode approuvée pour la production d'arénavirus recombinantes comme candidats potentiels de semences de vaccins. Ici, nous documentons l'utilisation du promoteur pol-I humain pour le sauvetage efficace de l'Ancien Monde prototypique (OW) VCML et le Nouveau Monde (NW) JUNV Candid n ° 1 souche dans des cellules Vero. En utilisant une méthodologie similaire, nous avons généré VCML recombinant trisegmented (r3LCMV) et franc # 1 (r3Candid n ° 1) arénavirus qui contiennent deux gènes étrangers supplémentaires encodés en deux segments d'ARN S différentes ^5. Ce nouveau système résulte non seulement un protocole très reproductible et simple, mais peut être immédiatement mis en oeuvre dans la production d'arénavirus comme vaccin recombinant potentiel ou de graines de vecteur de vaccin.

Protocol

1. Arenavirus Rescue transfection Notre système de sauvetage a été basée sur l'utilisation des deux II plasmides d'expression de la protéine de polymérase codant pour la nucléoprotéine (NP) et dépendante de l'ARN-ARN-polymérase (L), les facteurs agissant en trans virales nécessaires à la réplication d'ARN et de l'expression des gènes du génome de l'arénavirus 7, 19, et des plasmides capables de diriger la synthèse intracellulaire, par l'i…

Representative Results

Sauvetage réussi d'un arénavirus de type sauvage recombinant sera confirmée par la présence d'antigènes viraux utilisant IFA (Figure 5). Dans le cas des virus recombinants trisegmented, sauvetage virale réussie peut être évaluée en observant l'expression de GFP par microscopie à fluorescence (figure 6A). Sauvetage réussi sera confirmée par l'évaluation expression Gluc (figure 6B). Les résultats représentatifs illustrant le sauvetage réuss…

Discussion

Génération d'arénavirus recombinantes utilisant des techniques de génétique inverse à base de plasmides est devenu une approche largement utilisée pour l'étude des différentes facettes de la biologie arénavirus. Ici, nous documentons une amélioration cruciale pour le système actuel en effectuant arénavirus sauvetages dans des cellules Vero, permettant la génération potentielle de vaccins candidats approuvés par la FDA contre arénavirus et des vecteurs de vaccins contre d'autres maladies infe…

Materials

			Material and methods
			Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer’s recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA.