एंटीबॉडी धुंधला में<em> सी. एलिगेंस</em> "रुक क्रैकिंग" का प्रयोग
Summary
"रुक टूटेंगे," निमेटोड सी के भीतरी ऊतकों को प्रकाश में लाने के लिए एक विधि प्रोटीन स्थानीयकरण के लिए एंटीबॉडी के लिए एलिगेंस, प्रदर्शन किया है.
Abstract
सी. दाग एंटीबॉडी के साथ एलिगेंस, अपेक्षाकृत अभेद्य छल्ली रासायनिक या यांत्रिक विधियों द्वारा नजरअंदाज किया जाना चाहिए. "रुक टूटेंगे" शारीरिक रूप से, दो पक्षपाती स्लाइड्स के बीच नेमाटोड compressing उन्हें ठंड, और अलग स्लाइड खींच कर नेमाटोड से छल्ली खींचने के लिए इस्तेमाल एक विधि है. रुक टूटेंगे रासायनिक उपचार के बिना ऊतकों के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए एक सरल और तेजी से रास्ता प्रदान करता है और fixatives की एक किस्म के साथ प्रयोग किया जा सकता है. हालांकि, यह नमूनों में से कई का नुकसान होता है और आवश्यक संपीड़न यंत्रवत् नमूना विकृत. अभ्यास अच्छा आकारिकी साथ नमूने की वसूली को अधिकतम करने की आवश्यकता है. रुक टूटेंगे विशिष्ट निर्धारण की स्थिति, नमूने की वसूली, या कम गैर विशिष्ट धुंधला के लिए अनुकूलित किया है, लेकिन नहीं सभी मापदंडों के लिए एक ही बार किया जा सकता है. बहुत मुश्किल निर्धारण स्थितियों की आवश्यकता है और रासायनिक छल्ली permeabilize करने के लिए आवश्यक रासायनिक उपचार, treatmen बर्दाश्त कि एंटीबॉडी के लिएसमाधान में बरकरार नेमाटोड की टी पसंद किया जा सकता. एंटीबॉडी एक हल्का तय की आवश्यकता है या इष्टतम निर्धारण शर्तों अज्ञात हैं, तो फ्रीज खुर तेजी प्रतिरक्षी परख करने और ब्याज की प्रतिजन के लिए विशिष्ट subcellular और सेलुलर स्थानीयकरण जानकारी प्राप्ति कर सकते हैं एक बहुत ही उपयोगी तरीका प्रदान करता है.
Introduction
प्रोटीन के सेलुलर और subcellular स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए, वैज्ञानिकों को पारंपरिक रूप से विशेष रूप से विशेष रूप से प्रोटीन 1 पहचान करने के लिए चयनित एंटीबॉडी के साथ ऊतकों में चिह्नित किया है. ऐसे सी के रूप में कुछ मॉडल जीवों में एलिगेंस, एंटीबॉडी धुंधला अक्सर अधिक तेजी से परिणाम जो आणविक आनुवंशिक तकनीक, द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है. ये प्रमोटर और ब्याज और हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन के जीन की कोडिंग क्षेत्रों के बीच जीन fusions से मिलकर निर्माणों के साथ बदलने से जीवों में शामिल हैं. हालांकि, आणविक तकनीक सच प्रमोटर और उच्च प्रतिलिपि संख्या (सी एलिगेंस में सामान्य तकनीक) 2,3 पर निर्माणों की अभिव्यक्ति में परिवर्तन को जानने के साथ समस्याओं सहित कलाकृतियों की एक संख्या के अधीन हैं. इसलिए, एंटीबॉडी के साथ धुंधला vivo में प्रोटीन समारोह के अध्ययन के कई वैज्ञानिकों के लिए एक लक्ष्य रहता है.
एंटीबॉडी के साथ ऊतकों धुंधला हो जाना, मुश्किल हो सकता है क्योंकि एकtibodies केवल एक विशेष रचना 1 में उनके प्रतिजन पहचान सकते हैं. उदाहरण के लिए, एंटीबॉडी एक खास तरह से तय ही विकृत या बरकरार प्रतिजन पहचान सकते हैं और बगल में प्रतिजन नहीं पहचान सकता है. नेमाटोड में एंटीबॉडी धुंधला की समस्या निमेटोड की छल्ली ऊतकों के लिए एंटीबॉडी का उपयोग रोकने, एक अपेक्षाकृत अभेद्य बाधा रूपों है कि इस तथ्य से exacerbated है.
सी. में एंटीबॉडी धुंधला के लिए इस्तेमाल कई अलग अलग तरीके हैं एलिगेंस (हमारे पिछले काम में समीक्षा 4). बरकरार दाग 'कीड़े,' तरीके फ्रीज और एक अपेक्षाकृत कठिन लगानेवाला (formaldehyde या glutaraldehyde) में पिघलना करने के लिए विकसित किए गए, फ्रीज पिघलना चक्र लगानेवाला 5 का तेजी से प्रवेश की अनुमति के छल्ली दरार करने के लिए मदद करते हैं. तरीकों एजेंटों, collagenase, या दोनों 5-7 कम करने के साथ उपचार शामिल; निर्धारण के बाद, छल्ली एंटीबॉडी के प्रवेश को अनुमति देने के लिए permeabilized गया था. इन टीreatments आकारिकी संरक्षित है, लेकिन अक्सर एंटीबॉडी मान्यता कम या नष्ट कर दिया. वैकल्पिक तरीकों एंटीबॉडी प्रवेश की अनुमति के विच्छेदन 8 शामिल हैं.
"रुक टूटेंगे" एंटीबॉडी 9-10 धुंधला अनुमति देने के लिए अर्द्ध बरकरार कीड़ा के इंटीरियर के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए एक ही रास्ता है. Collagenase और कमी उपचार से परहेज करते हुए रुक टूटेंगे निर्धारण स्थितियों की एक किस्म के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है. नेमाटोड, दो चिपकने स्लाइड्स के बीच रखा गया है जमे हुए, और उसके बाद स्लाइड अलग हो रहे हैं, नीचे स्लाइड पर निमेटोड की सबसे अधिक है और ऊपर स्लाइड पर छल्ली की बहुत छोड़ रहे हैं. नीचे स्लाइड लगानेवाला में रखा जा सकता है और पालन नेमाटोड के साथ पूरे स्लाइड एंटीबॉडी धुंधला प्रक्रिया के माध्यम से स्थानांतरित किया है. विधि मौजूद दो बड़ी कठिनाइयों करता है. सबसे पहले, यह उन्हें गंभीरता से विरूपण के बिना नेमाटोड विभाजित करने के लिए आवश्यक दबाव की सही मात्रा में लागू करने के लिए मुश्किल है. दूसरा, कीड़े के कई नहीं होगाया तो स्लाइड पर टिक, और लगानेवाला या rinses में खो जाएगा. हालांकि, उचित स्लाइड और अभ्यास के साथ, विधि तेजी से fixatives और एंटीबॉडी के एक व्यापक विविधता के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, जो उचित आकारिकी साथ नेमाटोड निकलेगा.
विधि प्रयोगकर्ता के लक्ष्य पर निर्भर करता है, थोड़ा अलग किया जा सकता है. एकल नेमाटोड का धुंधला हो जाना (जैसे एक एकल transformant एंटीबॉडी धुंधला कर दिया है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए) वांछित है, तो अधिक से अधिक आसंजन साथ स्लाइड्स (लेकिन उच्च पृष्ठभूमि धुंधला) (नीचे देखें) इस तरह के अतिरिक्त polylysine के साथ प्रयोगशाला में तैयार स्लाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. नेमाटोड इन fixations के बाद polylysine को अधिक खराब पालन के बाद से formaldehyde या glutaraldehyde निर्धारण के लिए, उच्च आसंजन स्लाइड्स (प्रयोगशाला तैयार polylysine स्लाइड), इस्तेमाल किया जाना चाहिए. जंगली प्रकार नेमाटोड मेथनॉल और / या एसीटोन के साथ तय किया जा रहा है, तो कम आसंजन के साथ स्लाइड्स और कम पृष्ठभूमि धुंधला इस्तेमाल किया जाना चाहिए (वाणिज्यिक या एल) स्लाइड aboratory तैयार. एंटीबॉडी और fixatives की एक किस्म प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया जा रहा है, तो स्लाइड्स की एक चयन के समय से आगे तैयार किया जा सकता है और जब तक जरूरत संग्रहीत.
निमेटोड ऊतक के लिए पहुँच प्राप्त करने के बाद, एंटीबॉडी धुंधला प्रक्रियाओं (अब ऊतकों की विशेषता incubations बजाय कोशिकाओं 1,11) के साथ मानक तरीकों का पालन करें.
Protocol
Representative Results
Discussion
फ्रीज खुर प्रोटोकॉल सी. में एंटीबॉडी धुंधला के लिए कई तरीकों में से एक है एलिगेंस. यह कीड़े दाग एक अपेक्षाकृत सरल तरीका प्रदान करता है, लेकिन विशिष्ट अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है और अधिकतम परि?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अनुदान NSF CCLI # 0633618 और ओहियो विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किया गया. कुछ उपभेदों Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र द्वारा प्रदान किया गया. ग्रेजुएट छात्र Reetobrata बसु वीडियो में दिखाई देता है.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine slide (ESCO brand) | Fisher | 12-545-78 | Sigma brand slides also suitable |
| poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P1524 | IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical |
| single frosted edge slides | Fisher | 48312-002 | Other brands are suitable |
| sodium azide | Sigma | S2002-25G | TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution |
| coplin staining jar | VWR | 47751-792 | Other brands are suitable |
| 5-slide mailer | Electron Microscopy Science | 71549-01 | One of many different brands of small slide holder, suitable for staining |
| Paraformaldehyde | VWR | MK262159 | IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Glutaraldehyde solution, 25% in water | Sigma | G 5882 | IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Triton X-100 | VWR | EM-9410 | Other brands are suitable |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | ICN820451 | Other brands are suitable |
| Donkey Serum, lyophilized | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | Other brands are suitable |
| Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling | Jackson Immunoresearch | 715-165-150 | This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). |
| n-propyl gallate | Fisher | ICN10274750 | Other brands are suitable |
| DAPI, 4′,6′-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | D 9542 | TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure |
| Whatman #1 15 cm diameter filters | Fisher | 09805G | |
| Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm | VWR | 48393-252 | #1 1/2 thickness is optically best |
| Microscope slide folder | VWR | 48429-092 | Other brands are suitable |
References
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