Transsynaptique Tracing de cibles périphériques avec virus de la pseudo Suivi par la toxine cholérique et biotinylé Dextran Amines double marquage
Summary
Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.
Abstract
Le traçage transsynaptique est devenu un outil puissant utilisé pour analyser efferents centrales qui régulent cibles périphériques par le biais des circuits multi-synaptiques. Cette approche a été le plus largement utilisé dans le cerveau en utilisant le virus de la pseudorage porcine pathogène (PRV) 1. PRV ne pas infecter les grands singes, dont les humains, il est le plus souvent utilisé dans les études sur les petits mammifères, en particulier les rongeurs. La souche de la pseudorage PRV152 exprime la protéine fluorescente (eGFP) gène rapporteur verte améliorée et que traverse synapses fonctionnelles manière rétrograde à travers la séquence hiérarchique des connexions synaptiques de distance à partir du site d'infection de 2,3. D'autres souches de PRV ont des propriétés distinctes et microbiologiques peuvent être transportés dans les deux directions (PRV-Becker et Kaplan-PRV) 4,5. Ce protocole traitera exclusivement avec PRV152. En fournissant le virus à un site périphérique, par exemple muscle, il est possible de limiter l'entrée du virus dans til cerveau à travers un ensemble spécifique de neurones. Le motif de signal de eGFP résultant dans tout le cerveau résout alors les neurones qui sont reliés aux cellules infectées initialement. Comme la nature distribuée de traçage transsynaptique par le virus de la pseudo rend l'interprétation des connexions spécifiques au sein d'un réseau identifié difficile, nous présentons une méthode sensible et fiable utilisant des amines biotinylés dextran (BDA) et la toxine du choléra sous-unité B (CTB) pour confirmer les connexions entre les cellules identifiées à l'aide PRV152. La détection immunochimique de BDA et la CTB à la peroxydase et DAB (3, 3 'diaminobenzidine) a été choisi parce qu'ils sont efficaces à révéler les processus cellulaires, y compris les dendrites distales 6-11.
Introduction
Le traçage transsynaptique est devenu un outil puissant utilisé pour analyser efferents centrales qui régulent cibles périphériques par le biais des circuits multi-synaptiques. Cette approche a été le plus largement utilisé dans le cerveau de rongeurs en utilisant le virus de la pseudo pathogènes porcine (PRV), en particulier la souche atténuée PRV-Bartha décrite pour la première en 1961 12. Ici, nous présentons un protocole pour identifier la représentation corticale motrice des muscles spécifiques ou groupes de muscles à l'aide d'une souche de virus de la pseudorage recombinant (PRV152) exprimant la protéine de renforcement fluorescente verte (EGFP) gène rapporteur 2. La méthode décrite exploite le comportement des virus neurotropes, qui produisent une descendance infectieuse que les synapses croisées pour infecter d'autres neurones dans un circuit fonctionnel 3,4,13. PRV152, qui est isogénique avec PRV-Bartha, seule traverse synapses rétrograde à travers la séquence hiérarchique des connexions synaptiques en dehors du site d'infection 3,5 </ sup>. En contrôlant avec précision le site de l'infection périphérique, il est possible de limiter la pénétration du virus dans le cerveau à travers un sous-ensemble spécifique des motoneurones. Comme le virus infecte de manière séquentielle de chaînes de neurones connectés, le motif de signal de eGFP dans le cerveau résultant sera alors de résoudre le réseau de neurones qui sont reliés aux cellules infectées initialement.
Un avantage supplémentaire de l'utilisation de virus pour le traçage de neurones est l'amplification de la protéine rapporteur (eGFP dans ce cas) dans les cellules infectées. Cette amplification de signal fournit un niveau de sensibilité qui permet la détection des projections même clairsemés. Par exemple, une projection creuse de vibrisses de cortex moteur aux neurones moteurs faciaux contrôlant les whiskers a été trouvé chez les rats en utilisant viralement exprimé la protéine fluorescente verte 14; études précédentes ont échoué à trouver cette projection utilisant des traceurs classiques sans amplification du gène rapporteur 11,15. Malheureusement, De nombreux vecteurs de traçage virales, comme celui utilisé dans l'étude citée, ne traversent pas les synapses, ce qui limite leur utilisation pour le traçage des circuits multi-synaptiques.
Bien que présentant des avantages distincts pour identifier le réseau de cellules participant à un circuit de moteur, la nature distribuée transsynaptique de traçage avec PRV-152 rend l'interprétation de liaisons spécifiques dans le circuit difficile. Par conséquent, nous présentons une méthode simple pour valider les connexions spécifiques au sein de circuits identifiés en utilisant PRV-152 par double marquage utilisant des amines biotinylés dextran (BDA) et la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB). L'utilisation combinée de BDA et la CTB est une approche bien établie pour tracer des liens entre des ensembles spécifiques de neurones 6-8,11. Lorsqu'ils sont utilisés ensemble, ces deux traceurs peuvent être visualisées dans la même section en utilisant un DAB à deux couleurs (3, 3 'diaminobenzidine) procédure 16. Haut poids moléculaire BDA (BDA10kDa) a été choisi pour ce protocole parce qu'il yOMAINES étiquetage détaillé des processus neuronaux 6,7,9. Des avantages supplémentaires de BDA10kDa sont les suivants: il est de préférence transporté dans le sens antérograde 6-8; il peut être livré par iontophorèse ou l'injection de pression 6-8; il peut être visualisée par une simple avidine-HRP biotinylé de (ABC) 17 procédure; et il peut être imagée par microscopie optique ou électronique 6,7,18. La détection immunochimique de la CTB à la peroxydase et DAB a été choisi pour marquage rétrograde des motoneurones parce qu'il est efficace à révéler les processus cellulaires, y compris les dendrites distales 10,19. Nous avons récemment utilisé cette approche pour identifier la voie de moteur vocal chez la souris et de révéler une connexion clairsemée du cortex moteur primaire des neurones moteurs du larynx, qui était auparavant supposées être absent 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il ya un certain nombre de questions qui doivent être prises en considération lors de la planification d'une expérience utilisant PRV152 4,21. Plus important encore, virus de la pseudorage est létale. Comme mentionné précédemment, les grands singes, dont les humains ne sont pas sensibles à l'infection, mais des soins appropriés doivent être exercés pour protéger les autres animaux. Les souris adultes survivent généralement de cinq à sept jours après l'inoculation avec la souche att…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Toshio Terashima de l'Université de Kobe, au Japon, pour l'enseignement de la technique de la chirurgie du larynx, et le Dr Lynn Enquist de l'Université de Princeton pour fournir PRV-Bartha. Recherche a été soutenue par le NIH prix pionnier DP1 OD000448 Erich D. Jarvis et un prix NSF Graduate Research Fellowship à Gustavo Arriaga. Les chiffres de travail précédente de manière appropriée crédités sont utilisés dans le cadre du libre accès PLoS ONE licence Creative Commons (CC-BY) en conformité avec les politiques éditoriales de la revue.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 gauge option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| [header] | |||
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer > 1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/mL & 6 mg/mL |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/mL dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
- Card, J. P., Enquist, L. W. . Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, 1.51-1.5.28 (2001).
- Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
- Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
- Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
- Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
- Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
- Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
- Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
- Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
- Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
- Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).
- Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
- Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
- Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
- Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).
