Kvantitative<em> In vitro</em> Assay til måling neutrofiladhæsion til Aktiverede primære humane mikrovaskulære endotelceller under statiske forhold
Summary
Neutrofil tilslutning til den aktiverede endotel på steder med infektion er en integreret del af værtens inflammatoriske respons. Beskrevet i denne rapport er en neutrofil binding assay, der giver mulighed for<em> In vitro</em> Kvantificering af primær human neutrofil binding til endotelceller aktiveres af inflammatoriske mediatorer under statiske betingelser.
Abstract
Det vaskulære endotel spiller en integrerende del i det inflammatoriske respons. Under den akutte fase af inflammation, der endotelceller (EC'er) aktiveres ved værts mediatorer eller direkte af konserverede mikrobielle komponenter eller værtsafledte fare molekyler. Aktiverede ECS udtrykke cytokiner, kemokiner og adhæsionsmolekyler, der mobiliserer, aktivere og fastholde leukocytter på stedet for infektion eller skade. Neutrofiler er de første leukocytter at ankomme, og klæbe til endotelet gennem en række adhæsionsmolekyler stede på overfladerne af begge celler. De vigtigste funktioner i neutrofiler er direkte eliminere mikrobielle trusler fremme af ansættelse af andre leukocytter gennem frigivelse af yderligere faktorer, og igangsætte sårheling. Derfor er deres rekruttering og tilknytningen til endotel er et afgørende skridt i indledningen af den inflammatoriske respons. I denne rapport beskriver vi en in vitro neutrofiladhæsion assay hjælpcalcein AM-mærkede primære humane neutrofiler at kvantificere omfanget af mikrovaskulære endotelcelle aktivering under statiske forhold. Denne metode har den yderligere fordel, at de samme prøver kvantificeret ved fluorescens-spektrofotometri også kan visualiseres direkte ved hjælp af fluorescensmikroskopi for en mere kvalitativ vurdering af neutrofil binding.
Introduction
Da det vaskulære endotel er i direkte kontakt med det cirkulerende blod, er det unikt beliggende at indlede en hurtig inflammatorisk respons under infektion eller skade. Endotelceller (EC'er) udtrykkelige mønstergenkendelse receptorer, der genkender en række bevarede bakterielle komponenter og fare molekyler og receptorer for vært inflammatoriske mediatorer såsom TNF. Aktivering af disse receptorer inducerer EC'er at udskille cytokiner (f.eks IL-6, IL-8, CXCL1 og CCL2), og at opregulere adhæsionsmolekyler (fx E / P-selectin, VCAM-1 og ICAM-1) på deres celleoverflade 1 , 2.. Disse molekyler alle lette lokaliseringen af leukocytter til steder for infektion og skade for at rydde vært for smitstoffer og igangsætte væv reparation 3,4. Den neutrofile respons på infektion indebærer en velkoordineret samspil mellem det vaskulære endotel og reagerer neutrofiler. Ved EF aktivering, IL-8 udskilles og danner en intravaskulær gradient på endotelet, der tillader neutrofiler til hjem til stedet for infektion eller skade 5,6. E / P-selectiner mægle neutrofil indfangning og rullende gennem relativt svage associationer glycomolecules på neutrofile celleoverfladen. Disse interaktioner, sammen med IL-8 binding til dets kognate receptorer, lette robuste, integrin-medieret binding og eventuel anholdelse af neutrofiler på endotelcelleoverfladen 7-10. Efter anholdelse, kan neutrofile migrere ud af karrene til de specifikke steder for smitte til direkte at eliminere patogener, generere neutrofile ekstracellulære fælder for at forhindre spredning af patogener, fremme sårheling og frigøre yderligere faktorer, som rekrutterer andre leukocytter såsom monocytter, makrofager og dendritiske celler 11-17.
Beskrevet i denne rapport er en in vitro metode til at kvantificere neutrofil overholdelse microVascular EC'er efter aktivering af værten inflammatorisk mediator TNF. Denne analyse er at vurdere aktiveringen af ECS og ikke neutrofiler. Primære humane neutrofiler er først isoleret ved anvendelse densitetsgradient separation, og derefter mærket med calcein acetoxymethyl (AM). Esteraser i levende celler hydrolysere calcein AM til den meget fluorescerende calcein molekyle med et excitation af 492-495 nm og emission af 513-516 nm 18 år. De fluorescens-mærkede neutrofiler inkuberes derefter med EF-monolag, og ikke-adhærente neutrofiler efterfølgende fjernet. Fluorescensen af de resterende, bundne neutrofiler måles derefter ved hjælp af et fluorescensspektrofotometer, og beregnes som en procent af den samlede neutrofil fluorescens input per brønd. Denne metode har den yderligere fordel, at de bundne calcein-mærkede neutrofiler anvendes i spektrofotometri kan visualiseres direkte ved hjælp af fluorescensmikroskopi for at give en mere kvalitativ udlæses af EF acvation. Da dette assay udføres under statiske betingelser, vil kun de meget indledende begivenheder, der opstår i neutrofiladhæsion kaskade vurderes. Dette bekræftes i denne rapport ved hjælp E-selectin blokerende antistoffer at vise, at neutrofil overholdelse TNF-behandlet human lunge mikrovaskulære EC (HMVEC-Lung) monolag er drastisk reduceret, når samspillet med E-selectin er forstyrret.
Ud over TNFa, har vi med succes anvendt dette assay til at bestemme omfanget af menneskers navlevene EF (HUVEC) aktivering af Toll-like receptor 1/2 agonister peptidoglycan-associeret lipoprotein (PAL), murein lipoprotein (MLP) og Pam3Cys og HMVEC-Lunge aktivering med Pam3Cys 19,20. Desuden, vi succesfuldt anvendt dette assay med kinaseinhibitorer og efter RNAi-medieret knockdown af overflade-og cytoplasmiske proteiner i HMVEC-Lung, antyder, at denne metode er forenelig med en række biokemiske og screening assays 20. Sammenfattet indeholder denne analyse en nem at bruge, reproducerbar, mere funktionel måde at få adgang omfanget af EF-aktivering ved inflammatoriske mediatorer in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mest kritiske trin for en vellykket neutrofil / mikrovaskulære endotel celleadhæsionsassay er: 1) Anvendelse af lav passage nummer (<9), sunde endotelceller, 2) Opretholdelse af de isolerede neutrofiler ved en lav densitet (dvs. <5 x 10 6 celler / ml) og bruge dem inden for to timer isolation, og 3) Udsøgt vask af calcein AM-mærkede neutrofiler og brug af calcein AM-mærkede neutrofiler i tide for at minimere EF forurening og tab af calcein fra neutrofiler hhv .
<p class="jove_conten…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af UCSF Institut for Anæstesi og Perioperative Care.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | – |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
- Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
- Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
- Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
- Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
- Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
- Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
- Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. . The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , (2005).
- Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
- Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
- Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
- Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
- Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
- Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
- De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
- Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
- Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
- Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
- Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
- Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
- Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
- Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
- Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
- Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
- Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
- Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).
