मात्रात्मक<em> इन विट्रो में</emस्टेटिक शर्तों के तहत सक्रिय प्राथमिक मानव microvascular endothelial कोशिकाओं को न्युट्रोफिल आसंजन उपाय> परख
Summary
संक्रमण की साइटों पर सक्रिय अन्तःचूचुक को न्युट्रोफिल पालन मेजबान भड़काऊ प्रतिक्रिया का एक अभिन्न अंग है. के लिए अनुमति देता है कि एक न्युट्रोफिल बाध्यकारी परख है कि इस रिपोर्ट में वर्णित<em> इन विट्रो में</emस्थिर परिस्थितियों में सूजन मध्यस्थों से सक्रिय endothelial कोशिकाओं के लिए बाध्य प्राथमिक मानव न्युट्रोफिल के> quantitation.
Abstract
संवहनी endothelium भड़काऊ प्रतिक्रिया में एक अभिन्न भूमिका निभाता है. सूजन की तीव्र चरण के दौरान, endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) मेजबान मध्यस्थों द्वारा या सीधे संरक्षित माइक्रोबियल घटकों या मेजबान व्युत्पन्न खतरा अणुओं द्वारा सक्रिय कर रहे हैं. सक्रिय ईसीएस व्यक्त साइटोकिन्स, लामबंद कि chemokines और आसंजन अणुओं, संक्रमण या चोट के स्थल पर ल्यूकोसाइट्स सक्रिय करने और बनाए रखने के लिए. न्यूट्रोफिल आने से पहले ल्यूकोसाइट्स हैं, और दोनों कोशिकाओं की सतह पर मौजूद आसंजन अणुओं की एक किस्म के माध्यम से अन्तःचूचुक का पालन करें. neutrophils के मुख्य कार्य सीधे, माइक्रोबियल खतरों को खत्म अतिरिक्त कारकों की रिहाई के माध्यम से अन्य leukocytes की भर्ती को बढ़ावा देने, और घाव की मरम्मत शुरू करने के लिए कर रहे हैं. इसलिए, अन्तःचूचुक को उनकी भर्ती और लगाव भड़काऊ प्रतिक्रिया की दीक्षा में एक महत्वपूर्ण कदम है. इस रिपोर्ट में, हम का उपयोग करते हुए एक इन विट्रो न्युट्रोफिल आसंजन परख में वर्णनcalcein स्थिर परिस्थितियों में microvascular endothelial सेल सक्रियण की हद quantitate को प्राथमिक मानव जीवाणुओं AM लेबल. इस विधि प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा quantitated ही नमूने भी सीधे न्युट्रोफिल बंधन का एक और अधिक गुणात्मक मूल्यांकन के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कल्पना की जा सकती है कि अतिरिक्त लाभ है.
Introduction
संवहनी endothelium घूम रक्त के साथ सीधे संपर्क में है, यह विशिष्ट संक्रमण या चोट के दौरान तेजी से भड़काऊ प्रतिक्रिया आरंभ करने के लिए स्थित है. Endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) संरक्षित बैक्टीरियल घटकों और खतरे अणुओं की एक किस्म की पहचान है कि एक्सप्रेस पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स, और इस तरह के TNFα के रूप में मेजबान भड़काऊ मध्यस्थों के लिए रिसेप्टर्स. इन रिसेप्टर्स की सक्रियण ईसीएस साइटोकिन्स (जैसे आईएल -6, आईएल -8, CXCL1 और CCL2) स्रावित करने के लिए, और उनके कोशिका की सतह 1 पर आसंजन अणु (जैसे ई / पी selectin, Vcam-1 और 1-ICAM) upregulate करने के लिए प्रेरित करता है , 2. इन अणुओं सभी संक्रामक एजेंटों के मेजबान स्पष्ट और ऊतकों की मरम्मत 3,4 आरंभ करने के क्रम में संक्रमण और चोट की साइटों के लिए leukocytes के स्थानीयकरण की सुविधा. संक्रमण को न्युट्रोफिल प्रतिक्रिया संवहनी endothelium और जवाब के बीच एक अच्छी तरह से समन्वित परस्पर क्रिया शामिल है जीवाणुओं. चुनाव आयोग सक्रियण पर, आईएल8 स्रावित और संक्रमण या चोट 5,6 की साइट के लिए घर के लिए जीवाणुओं की अनुमति देता है कि अन्तःचूचुक पर एक intravascular ढाल रूपों है. ई / पी selectins मध्यस्थता न्युट्रोफिल पकड़ने और न्युट्रोफिल कोशिका की सतह पर glycomolecules साथ अपेक्षाकृत कमजोर संघों के माध्यम से रोलिंग. इन मुलाकातों, अपने आत्मीय रिसेप्टर्स करने के लिए आईएल -8 बंधन के साथ, मजबूत, इंटीग्रिन की मध्यस्थता लगाव और endothelial सेल सतह 7-10 पर neutrophils की संभावित गिरफ्तारी की सुविधा. गिरफ्तारी के बाद neutrophils, सीधे, रोगजनकों को खत्म रोगजनकों के प्रसार को रोकने के लिए न्युट्रोफिल कोशिकी जाल उत्पन्न, घाव भरने को बढ़ावा देने और इस तरह monocytes, मैक्रोफेज और वृक्ष के समान ही अन्य ल्यूकोसाइट्स भर्ती कि अतिरिक्त कारकों को रिहा करने के लिए संक्रमण के विशिष्ट साइटों के लिए वाहिका संरचना से बाहर पलायन कर सकते हैं कोशिकाओं 11-17.
Microv को न्युट्रोफिल पालन quantitate को एक में इन विट्रो विधि है इस रिपोर्ट में वर्णितascular TNFα मेजबान भड़काऊ मध्यस्थ द्वारा सक्रियण के बाद ईसीएस. यह परख ईसीएस के सक्रियण, और नहीं जीवाणुओं का आकलन करने के लिए बनाया गया है. प्राथमिक मानव जीवाणुओं पहले घनत्व ढाल जुदाई का उपयोग कर अलग कर रहे हैं, और फिर calcein acetoxymethyl (एएम) के साथ लेबल रहे हैं. जीवित कोशिकाओं Hydrolyze calcein भीतर Esterases 492-495 एनएम और 513-516 एनएम 18 के उत्सर्जन के एक उत्तेजना के साथ अत्यधिक फ्लोरोसेंट calcein अणु AM. fluorescently लेबल neutrophils, तो चुनाव आयोग monolayers के साथ incubated हैं, और गैर पक्षपाती neutrophils के बाद हटा रहे हैं. शेष, बाध्य neutrophils की रोशनी तो एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके मापा, और अच्छी तरह से प्रति कुल न्युट्रोफिल प्रतिदीप्ति निवेश का एक प्रतिशत के रूप में गणना की है. इस विधि स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री में इस्तेमाल बाध्य calcein लेबल neutrophils के सीधे चुनाव आयोग एसी से बाहर पढ़ने के लिए एक और अधिक गुणात्मक देने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कल्पना की जा सकती है कि अतिरिक्त लाभ हैtivation. इस परख स्थिर शर्तों के तहत किया जाता है, न्युट्रोफिल आसंजन झरना में होते हैं कि केवल बहुत प्रारंभिक घटनाओं का मूल्यांकन किया जाएगा. इस TNFα का इलाज मानव फेफड़े microvascular चुनाव आयोग (HMVEC-फेफड़े) को उस न्युट्रोफिल पालन ई selectin के साथ बातचीत बाधित है जब monolayers काफी कम है दिखाने के लिए ई selectin अवरुद्ध एंटीबॉडी का उपयोग इस रिपोर्ट में पुष्टि की है.
TNFα के अलावा, हम सफलतापूर्वक टोल की तरह रिसेप्टर 1/2 एगोनिस्ट पेप्टीडोग्लायकन जुड़े लिपोप्रोटीन (पाल), murein लिपोप्रोटीन (MLP) और Pam3Cys और द्वारा मानव नाल की शिरा चुनाव आयोग (HUVEC) सक्रियण की सीमा निर्धारित करने के लिए इस परख का इस्तेमाल किया है Pam3Cys 19,20 से HMVEC-फेफड़े सक्रियण. इसके अलावा, हम सफलतापूर्वक इस पद्धति की एक किस्म के साथ संगत है, सुझाव है कि kinase inhibitors के साथ और HMVEC-फेफड़े में सतह और cytoplasmic प्रोटीन की आरएनएआई की मध्यस्थता पछाड़ना के बाद इस परख इस्तेमाल जैव रासायनिक और screeninजी assays के 20. सारांश में, इस परख इन विट्रो में सूजन मध्यस्थों द्वारा चुनाव आयोग के सक्रियण की हद तक पहुंचने के लिए, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने, अधिक कार्यात्मक रास्ते का उपयोग करने के लिए आसान प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक सफल न्युट्रोफिल / microvascular endothelial सेल आसंजन परख के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) कम बीतने संख्या (<9), स्वस्थ endothelial कोशिकाओं का प्रयोग करें, एक कम घनत्व (यानी <5 x 10 6 कोशिकाओं को अलग जीवाणुओं को बनाए रखने 2…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम संज्ञाहरण और Perioperative केयर के UCSF विभाग द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | – |
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