Nøytrofile tilslutning til aktivert endotel på nettstedene til infeksjon er en integrert del av vertens inflammatorisk respons. Beskrevet i denne rapporten er en nøytrofile bindingsanalyse som gir mulighet for<em> In vitro</em> Kvantifisering av primær menneskelig nøytrofile binding til endotelceller aktiveres av inflammatoriske mediatorer under statiske forhold.
Blodåreendotelets spiller en vesentlig rolle i den inflammatoriske respons. I den akutte fasen av betennelse, er endotelceller (ECS) aktiveres av vert meklere eller direkte av konserverte mikrobielle komponenter eller host-avledet fare molekyler. Aktiverte egenkapitalbevis uttrykke cytokiner, chemokiner og adhesjonsmolekyler som mobiliserer, aktivere og beholde leukocytter på stedet av infeksjon eller skade. Nøytrofile granulocytter er de første leukocytter å ankomme, og holder seg til endotelet gjennom en rekke adhesjonsmolekyler tilstede på overflaten av begge celler. De viktigste funksjonene til nøytrofile er å direkte eliminere mikrobielle trusler, fremme rekruttering av andre leukocytter gjennom utgivelsen av flere faktorer, og initiere sår reparasjon. Derfor er rekruttering og vedlegg til endotelet et kritisk punkt i initiering av den inflammatoriske respons. I denne rapporten beskriver vi en in vitro nøytrofile vedheft analysen hjelpCalcein AM-merket primære humane neutrofiler til å kvantifisere omfanget av mikrovaskulær endotelial celleaktivering under statiske forhold. Denne metode har den ytterligere fordel at de samme prøvene kvantifisert ved fluoresens-spektrofotometri kan også visualiseres direkte ved hjelp av fluorescens-mikroskopi for en mer kvalitativ vurdering av nøytrofil binding.
Siden det vaskulære endotel er i direkte kontakt med det sirkulerende blod, er det en unik plassert for å initiere en hurtig inflammatorisk respons under infeksjon eller skade. Endotelceller (ECS) uttrykte mønstergjenkjenning reseptorer som gjenkjenner en rekke bevarte bakterielle komponenter og fare molekyler, og reseptorer for vert inflammatoriske mediatorer som TNF-alfa. Aktivering av disse reseptorene ECS å utskille cytokiner (for eksempel IL-6, IL-8, CXCL1 og CCL2), og å oppregulere adhesjonsmolekyler (f.eks E / P-selektin, VCAM-1 og ICAM-1) på deres celleoverflate ett , 2.. Disse molekylene alt til rette for lokalisering av leukocytter til nettsteder for infeksjon og skade for å fjerne vert for smittestoffer og initiere vev reparasjon 3,4. Den nøytrofile responsen på infeksjon innebærer en godt koordinert samspill mellom blodåreendotelets og svarer nøytrofile. Ved EF-aktivering, IL-8 utskilles og danner en intravaskulær gradient på endotelet som gjør at nøytrofile hjemme på stedet for infeksjon eller skade 5,6. E / P-selectins megle nøytrofile fangst og rulle gjennom relativt svake assosiasjoner med glycomolecules på nøytrofile celleoverflaten. Disse interaksjonene, sammen med IL-8 binding til sine beslektede reseptorer, lette robust, integrinantistoff-mediert vedlegg og eventuell arrestasjon av nøytrofile på endotelceller overflaten 7-10. Etter arrestasjonen, kan nøytrofile migrere ut av blodkar til de spesifikke områder av smitte til direkte eliminere patogener, generere nøytrofile ekstracellulære feller for å hindre spredning av patogener, fremme sårheling og utgi flere faktorer som rekrutterer andre leukocytter som monocytter, makrofager og dendrittiske celler 11-17.
Beskrevet i denne rapporten er en in vitro metode for å kvantifisere nøytrofile tilslutning til microVascular egenkapitalbevis etter aktivering av verten inflammatorisk megler TNF-alfa. Denne analysen er laget for å vurdere aktivering av egenkapitalbevis, og ikke nøytrofile. Primære humane neutrofiler er først isolert ved hjelp av densitetsgradient separasjon, og blir deretter merket med Calcein acetoksymetyl (AM). Esterasene innenfor levende celler hydrolyze Calcein AM til den svært fluorescerende Calcein molekyl med en eksitasjon av 492-495 nm og utslipp av 513-516 nm 18. De fluorescently-merket nøytrofile blir deretter inkubert med EF monolagene, og ikke-heftende nøytrofile senere blir fjernet. Fluorescensen av de gjenværende, bundne nøytrofiler blir så målt ved hjelp av et fluorescens-spektrofotometer, og beregnes som en prosent av total neutrofil fluorescens inndata per brønn. Denne metode har den ytterligere fordel at de bundne Calcein-merkede nøytrofiler som brukes i spektrofotometri direkte kan visualiseres ved hjelp av fluorescens-mikroskopi for å gi en mer kvalitativ lest ut av EC acaktiverings. Siden denne analysen er utført under statiske forhold, vil bare de aller første hendelser som oppstår i nøytrofile vedheft kaskade bli vurdert. Dette bekreftes i denne rapporten bruker E-selektinantistoffer blokkerende antistoffer for å vise at nøytrofile tilslutning til TNF-alfa-behandlet menneskelig lunge microvascular EC (HMVEC-Lung) monolagene er drastisk redusert når samspillet med E-selectin blir forstyrret.
I tillegg til TNF-alfa, har vi med hell brukt denne analysen for å fastslå omfanget av menneskelig umbilical vein EC (HUVEC) aktivering av Toll-like receptor 1/2 agonister peptidoglycan-assosiert lipoprotein (PAL), murein lipoprotein (MLP) og Pam3Cys og HMVEC-Lung aktivering av Pam3Cys 19,20. I tillegg har vi med hell brukt denne analysen med kinase hemmere og etter RNAi-mediert knockdown av overflaten og cytoplasmatiske proteiner i HMVEC-Lung, som tyder på at denne metodikken er kompatibel med en rekke biokjemiske og screening-analyser 20. Oppsummert gir denne analysen en lett å bruke, reproduserbar, mer funksjonell måte å få tilgang til omfanget av EC aktivering av inflammatoriske mediatorer in vitro.
De mest kritiske trinn for en vellykket neutrofil / mikrovaskulær endotelcelle-adhesjon analysen er: 1) Anvendelse av lav passasje nummer (<9), sunne endotelceller, 2) opprettholdelse av de isolerte nøytrofiler ved en lav tetthet (dvs. <5 x 10 celler 6 / ml) og bruker dem innen to timer med isolasjon, og 3) Smakfullt vask av Calcein AM-merket nøytrofile og bruk av Calcein AM-merket nøytrofile i tide for å minimere EC forurensning og tap av Calcein fra de nøytrofile, henholdsvis .
<p c…The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av UCSF Institutt for anestesi og Perioperative Care.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | – |