Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol
Summary
Faj gösterimi, bir ilgi hareketsiz molekülü ile etkileşen proteinleri ya da protein parçaları yakalamak için güçlü bir tekniktir. Oluşturmak için faj cDNA kütüphanesi türüne ve ekranın bir karar yapıldıktan sonra, burada açıklanan protokol interactors tanımlanmasına yol açan verimli benzeşim seçimine izin verir.
Abstract
Hareketsiz yem moleküllerine yönde klonlanmış bir cDNA kütüphanesi ile kodlanan çeşitli protein kısımlarını sunmak için bir iskele olarak yeniden birleştirici faj kullanılarak etkileşimleri keşfetmek için etkili bir araçtır. Bu teknik, büyük ölçüde, protein-protein etkileşimleri keşfetmek için kullanılmıştır ama meydan için yem molekül proteinleri ile sınırlı olmak zorunda değildir. Burada sunulan protokol yemler mütevazı bir dizi aynı protein sunum bağımsız klonların belirlenmesini maksimize etmek için tekrardan ekranlı izin vermek için optimize edilmiştir. Bu tespit etkileşen proteinlerin yem molekülün yasal Uygulayıcılar olduğu daha büyük bir güven izin verir. Her afinite seçimden sonra faj titresi İzleme yuvarlak yakınlık seçme negatif kontrollerin etkinliği yanı sıra nasıl ilerlediğini bilgi sağlar. Bir faj titering ve nasıl anlamına gelir ve ne bu süreç verimli olarak ilerleme sağlamak için önceden hazırlamakMümkün olduğunda, sunulmuştur. Bağımsız plak izolasyonu aşağıdaki alınan amplikonların Özellikler afinite seçimi ilerlemiştir ne kadar iyi belirlemek için kullanılabileceğini vurgulanır. Sorun yanlış pozitif veya en aza indirmek için ısrarla fajının geri atlamak için çekim teknikleri açıklanmıştır. Viral bulaşma nöbetini azaltılması araçlar tartışılmıştır.
Introduction
Neden bunun yerine diğer moleküllerle protein etkileşimleri keşfetmek ve araştırmak için kullanılabilir sayısız diğer tekniklerin faj ekran ve afinite seçimi kullanmak? Faj görüntüleme dahil olmak üzere şu protein-ligand etkileşimleri 1-3 saptanmasında diğer yöntemlere göre bazı benzersiz avantajlar iddia edemez:
Yem moleküllerin çok geniş repertuarı
Önde gelen nedeni yakınlık seçimi 4 yem olarak etki edebilme yeteneğine sahip moleküllerin çeşitliliği bulunmaktadır. Faj gösterimi, bir polimer / molekül, elde edilebilir bir desteğe bağlı olabilir Esasen, bu faj gösterilen proteinlerle yakınlık için taranmalıdır diğer proteinler, nükleotitler, karbonhidratlar vb 5 etkileşim protein fragmanlarının izole edilmesi için bir çok güçlü bir araçtır. R koşullar için kullanılan, ayrıca, yem molekülü, 6, hareketsiz olduğunda biyolojik aktivitesini muhafaza olup olmadığını belirlemek için erişilebiliretkinliğini ortadan kaldırmak / çıkarmak önce yakınlık seçimi için yem dönüşüm sonrası değişikliğe tanıtmak için, 6 ya da etkili bulunmaktadır.
Yabancı faktörlere faj direnç
Faj ekranı kullanarak ikinci bir sebebi, bazı yemler onların etkileşim proteinlerini yakalamak için çevresel stres (ısı, yüksek osmolite konsantrasyonları, belirli kofaktörler, vb.) Gerektirebilir mümkün olduğunu, ya da faj görüntülenen proteinler şekilde değiştirilmesi gerekebilir afinite seçimi öncesinde. Çalışılmaktadır birincil faktör yem ve protein değil, bu test organizması için ölümcül ise etkileşim meydana sağlar veya durum arasındaki etkileşimdir. O (T7 canlılığı için yayınlanan termik maksimum ~ 60 ° C 7 eg) sağlam ve kalıcı hem de sert deneysel koşullara dayanabilir, çünkü T7 faj tür çalışmalarda özellikle uygundur. Değiştiren faj bir örnek olarak gösterilen proonarım enzimi protein yüzeyler için Arabidopsis thaliana tohum proteomesini incelerken proteinlerden, protein Isoaspartyl Metil Transferaz (PIMT), bu çalışmalarda kullanılan virüs girmesini teşvik etmek, önce her bir yakınlık seçimi için yuvarlak, bir hafta boyunca "yaşlı" olmuştu isoaspartate of (IsoAsp) tanımak ve onarım / tür anormallikleri metabolize organizmalarda mümkün değildir duyarlı proteinlerin 6 artıkları.
Metabolik olarak atıl
Ayrıca, faj genellikle metabolik zehirler ve, en azından, metabolik açıdan aktif bir test organizmalar üzerinde pleitropik etkilere neden olur küçük moleküller müdahale dayanıklıdır. Sıkılık yıkama sonrasında, zehir zehir bakteri ya da daha sonraki faj replikasyon için zararsız bir aralığa seyreltilir böylece bakterilerin büyük bir hacmi enfeksiyonu için kabul edilmeden önce çıkarılır. PIMT onarım protein hedeflerini araştırırkenenzim, S-adenosil Metionin (AdoMet) enzimi inaktive ve yararlı bir negatif kontrol olarak sağlamak temin etmek üzere S-adenosil homosistein (AdoHcy) dayanarak iken bir hedef protein yakalama izin vermek için mikro titre plaka oyuklu hareketsizleştirilmiş enzimin aktive etmek için kullanıldı virüs olumsuz AdoMet veya AdoHcy 6 ya etkisinde değil ki bilgi. Ayrıca, bu laboratuarda araştırılmıştır bazı Geç Embriyo bol (LEA) protein ailesine ait üyeleri noktasında, soya fasulyesi tohumlannda 200 mM kadar yüksek konsantrasyonlar elde etmek için böyle 8 sakroz gibi katkı maddelerinin varlığında, kendi şeklini değiştirmek bilinmektedir fizyolojik olgunluk 9. Virüs bağımsız olarak uygun bir test organizmasının 10 için geçerli değil belirli LEA istemci-protein etkileşimleri için muhtemelen gerekli olan, her afinite seçimi yuvarlak, 200 mM sükroz ilave etkilendiği tahmin edilmez.
Bu laboratuvar açığa çıkarılması odaklanmıştırg protein-protein dehidrasyon 11 ya da tohum 6 batırılmış sonra IsoAsp oluşumuna yatkındır saklı proteomun bileşenlerinin onarımı sırasında depolanmış proteom koruma mekanizması altında yatan olgun, susuz ya da çimlenme tohumlarda etkileşimleri. Bu nedenle, üretim ve arıtma aktif halde yem olarak gerekli olan yeniden birleştirici proteinlerin, ve immobilize edilir önce ve sonra genellikle zordur, çalışmalarımız için bir köşe olmasına rağmen bunlar, çok kalmasını sağlamaktır. Her bir rekombinant protein üretim senaryo farklı olduğu, ancak, yeniden birleştirici protein üretimi için optimize koşullar burada ele alınmayacaktır. Kullanıcılar (bir enzim ise mikrotiter plaka kuyularda bir enzim tahlili yapmak gibi) hareketsiz protein hala işlevsel olup olmadığını belirlemek için, mümkün olan her yerde, denemek için teşvik edilmektedir. Bu herhangi keşfetti etkileşimleri olduğunu, yem nedenle biyolojik olarak aktif olduğunu ve bazı güven sağlayacakbiyolojik ilgisi var biraz daha olasıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Üç çoğaltılmış kuyularda deneyi çalıştırarak, yem bağlanma aynı proteinin, bağımsız bir şekilde edinilen faj aynı klon elde edilmiş olan CDS bölgenin nükleotid dizisi içinde (yani, hiç bir fark ancak bu olması bile ayırt edilebilir ) bağımsız kuyulardan alınan. Aksi takdirde, yem bağlanmasının, aynı proteini kodlayan faj arasında ayırt etmek için tek yoldur bunlar bağımsız bir şekilde, söz konusu nükleotid dizinin bir bölümünde farklı bölgeleri ters transkribe ise….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), USDA Tohum Grant (2011-04375), ve ABD'ye Sir Frederick McMaster Araştırma Bursu; Bu proje kısmen bir NSF IOS (0849230) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Becton Dickinson Co. | 211705 | |
| Yeast Extract | Becton Dickinson | 212750 | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Agarose | Research Products International | A20090 | |
| Blocking Reagent | EMD Chemicals Inc. | 69064 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Escherichia coli BLT5403 | EMD Chemicals Inc. | BLT5403 | Genotype: F- ompT hsdSB (rB – mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR) |
| ampicillin, Sodium Salt | Research Products International | A40040 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP102-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Corp. | A-9647 | |
| penta-HIS primary antibody | Qiagen Inc. | 34660 | |
| Goat anti mouse alkaline phosphatise conjugate | Sigma-Aldrich Corp. | A-5153 | |
| para-nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich Corp. | N-7653 | |
| T7-UP primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′ | |
| T7-DOWN primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′ | |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen Inc. | 28104 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen Inc. | 28706 | |
| Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Invitrogen Life Technologies | 4336917 | |
| Heating Block | Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) | 18780 | |
| 96 Well Cell Culture Plates | Corning | Costar 3590 | |
| Isotemp Incubator Oven | Fisher Scientific | 516D | |
| Pasteur Pipets, 5 ¾” | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| ChromaView Transilluminator | UVP Inc. | TS-15 | |
| UV Shield | Oberon | 071AF | |
| Gloves, Nitrile | Fisher Scientific | 19-170-010C | |
| Sterile 1.5 ml tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 10 ml borosilicate Pipets | Fisher Scientific | 13-678-25E | |
| Borosilicate culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-27 | |
| Uniskan I, ELISA plate reader | Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland | Type 362 |
References
- Georgieva, Y., Konthur, Z. Design and screening of M13 phage display cDNA libraries. Molecules. 16, 1667-1681 (2011).
- Beghetto, E., Gargano, N. Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery. Molecules. 16, 3089-3105 (2011).
- Li, W. ORF phage display to identify cellular proteins with different functions. Methods. 58, 2-9 (2012).
- Willats, W. G. Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).
- Konthur, Z., Crameri, R. High-throughput applications of phage display in proteomic analyses. Targets. 2, 261-270 (2003).
- Chen, T., et al. Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning. J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).
- Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).
- Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins. Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).
- Egli, D. B., Bruening, W. P. Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean. Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).
- Badotti, F., et al. Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).
- Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display. Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).
- Gasser, B., et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).
- Daly, R., Hearn, M. T. W. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).
- Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).
- Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions. Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).
- Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production. Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
