اشتقاق مدار الساعة من تخليص الغلوتامات مع تحليل Deconvolution من التيارات الناقل نجمي
Summary
نحن تصف طريقة تحليلية لتقدير عمر الغلوتامات في الأغشية نجمي من التسجيلات الكهربية من التيارات نقل الغلوتامات في الخلايا النجمية.
Abstract
وتوجد أعلى كثافة من نقل الغلوتامات في الدماغ في الخلايا النجمية. الغلوتامات زوجين نقل الحركة من الغلوتامات عبر الغشاء مع الرئيسين نقل 3 نا + و 1 H + ومكافحة نقل 1 K +. يمكن رصد التيار القياس المتكافئ التي تم إنشاؤها بواسطة عملية النقل مع خلية كاملة التسجيلات التصحيح، المشبك من الخلايا النجمية. يتشكل مدار الساعة من الحالية التي سجلتها مدار الساعة من الملف الشخصي الغلوتامات تركيز التي تتعرض لها الخلايا النجمية، حركية نقل الغلوتامات، وخصائص تيار كهربي السلبي للأغشية نجمي. نحن هنا وصف الطرق التجريبية والتحليلية التي يمكن استخدامها لتسجيل التيارات نقل الغلوتامات في الخلايا النجمية وعزل بالطبع وقت التخليص الغلوتامات من جميع العوامل الأخرى التي تشكل الموجي من التيارات نقل نجمي. الأساليب المذكورة هنا يمكن أن تستخدم لتقدير مدى الحياة سو فلاش uncaged وsynaptically صدر الغلوتامات في الأغشية نجمي في أي منطقة من الجهاز العصبي المركزي أثناء الصحة والمرض.
Introduction
الخلايا النجمية هي واحدة من أنواع الخلايا الأكثر وفرة في الدماغ مع على شكل نجمة التشكل ونتوءات غشاء غرامة التي تمتد في جميع أنحاء neuropil وتصل المجاورة اتصالات متشابك 1،2. هي معبأة غشاء الخلية في الخلايا النجمية "مكتظة مع جزيئات نقل الغلوتامات 3. في ظل الظروف الفسيولوجية، نقل الغلوتامات ربط بسرعة الغلوتامات في الجانب خارج الخلية من غشاء وتحويلها إلى السيتوبلازم الخلية. من خلال القيام بذلك، ونقل حفاظ على انخفاض تركيز القاعدية من الغلوتامات في الفضاء خارج الخلية 4. يتم وضع نقل الغلوتامات في عمليات نجمي غرامة المتاخمة لاستثاري نقاط الاشتباك العصبي في مكان مثالي لربط الغلوتامات صدر خلال الأحداث متشابك كما ينشر بعيدا عن المشقوق متشابك. من خلال القيام بذلك، ونقل أيضا إلى الحد من انتشار الغلوتامات نحو شبه والمناطق خارج متشابك وعلى نقاط الاشتباك العصبي المجاورة، والحد من انتشار المكاني للإشارة مثيرق في الدماغ 5-7.
النقل الغلوتامات هو عملية كهربي بالإضافة إلى stoichiometrically حركة نا 3 + H + 1 وعلى طول بهم الكهروكيميائية والتدرج في مكافحة النقل من 1 K + 8. ويرتبط النقل الغلوتامات مع (ولكن ليس إلى جانب stoichiometrically ل) وهو تصرف أنيوني نفاذا إلى SCN – (ثيوسيانات)> NO 3 – (نترات) ≈ ويتوافق 4 – (بيركلورات)> I -> BR -> الكلورين -> F -، وليس لCH 3 SO 3 – (الميثان سلفونات) وC 6 H 11 O 7 – (غلوكونات) 9-11. كلا التيارين (القياس المتكافئ وغير متكافئة) يمكن تسجيلها من خلال الحصول على كامل الخلية التسجيلات التصحيح، المشبك من الخلايا النجمية، حدد بصريا تحت Dodt الإضاءة أو الأشعة تحت الحمراء الفرق المقابل تدخل (IR-DIC) في acutه شرائح الدماغ 12. المكون متكافئة من التيار المرتبطة بالنقل الغلوتامات عبر الغشاء يمكن أن تكون معزولة باستخدام CH 3 SO 3 -، أو C 6 H 11 O 7 – الحلول المستندة إلى داخل الخلايا ويمكن حركها الغلوتامات فلاش uncaging على الخلايا النجمية 13،14، أو من خلال تفعيل الافراج الغلوتامات من نقاط الاشتباك العصبي المجاورة، إما كهربائيا أو 12 مع جهاز تحكم optogenetic المستهدفة.
يتشكل مدار الساعة من المكون متكافئة من التيار نقل بواسطة عمر الملف الشخصى تركيز الغلوتامات في الأغشية نجمي (أي إزالة الغلوتامات)، حركية نقل الغلوتامات، خصائص الغشاء السلبي من الخلايا النجمية، وخلال التحفيز متشابك، من قبل التزامن من الافراج الغلوتامات عبر نقاط الاشتباك العصبي المنشط 13. نحن هنا وصف بالتفصيل الكامل: (1) على APPR التجريبيةoach لعزل العنصر متكافئة من التيارات نقل الغلوتامات من خلية كاملة التسجيلات التصحيح، المشبك من الخلايا النجمية باستخدام الماوس شرائح الحصين الحادة بمثابة إعداد التجريبية سبيل المثال، (2) نهجا تحليليا لاستخلاص بالطبع وقت التخليص الغلوتامات من هذه التسجيلات 13، 14. هذه الطرق يمكن استخدامها لتسجيل وتحليل التيارات نقل الغلوتامات من الخلايا النجمية في أي منطقة من الجهاز العصبي المركزي.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا وصف نهج تجريبي للحصول على التسجيلات الكهربية من الخلايا النجمية، بروتوكول التحليلية لعزل التيارات نقل الغلوتامات في الخلايا النجمية وطريقة رياضية لاشتقاق بالطبع وقت التخليص الغلوتامات من التيارات نقل نجمي.
نجاح التحلي…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية برنامج بحوث جماعية (NS002986). كما كتب مخطوطة وتنفيذ تحليل deconvolution. وضعت دكتوراه النسخة الأولية من تحليل deconvolution وعلق على النص.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| CGP52432 | Tocris | 1246 | |
| (R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
| DPCPX | Tocris | 439 | |
| LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
| MSOP | Tocris | 803 | |
| NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
| D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
| Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
| Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
| Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
| Igor Pro 6 | Wavemetrics |
References
- Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
- Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus. Glia. 55, 13-23 (2007).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- Herman, M. A., Jahr, C. E. Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice. J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).
- Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake. Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).
- Barbour, B. An evaluation of synapse independence. J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).
- Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation. J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).
- Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. Flux coupling in a neuronal glutamate transporter. Nature. 383, 634-637 (1038).
- Eliasof, S., Jahr, C. E. Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).
- Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport. Neuron. 15, 721-728 (1995).
- Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel. J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H. Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).
- Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).
- Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina. J. Physiol. 436, 169-193 (1991).
- Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters. J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation. J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).
- Benediktsson, A. M., et al. Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes. Glia. 60, 175-188 (2012).
- Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).
- Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1. J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).
