성상 세포 운송업자 전류의 디컨 볼 루션 분석 글루타민산 정리의 시간 과정을 도출
Summary
우리는 성상 세포의 글루타메이트 수송 전류의 전기 생리학 녹음에서 성상 세포 막에 글루타민산의 수명을 추정하는 분석 방법을 설명합니다.
Abstract
뇌의 글루타메이트 수송의 가장 높은 밀도는 성상 세포에서 발견된다. 3 나 + 1 H의 공동 수송 + 1 K의 반대 교통과 막에 걸쳐 글루타민산 글루타민산 염 수송 커플 운동 +. 전송 프로세스에 의해 생성 된 화학 양론 현재는 성상 세포에서 전체 세포 패치 – 클램프 녹음으로 모니터링 할 수 있습니다. 기록 된 현재의 시간 코스는 성상 세포가 노출하는 글루타메이트 농도 프로파일, 글루타민산 염 수송의 동역학, 그리고 성상 세포 세포막의 수동 electrotonic 속성의 시간 경과에 의해 형성된다. 여기에서 우리는 성상 세포의 글루타메이트 수송 전류를 기록하고 성상 세포 수송 전류의 파형을 형성하는 다른 모든 요인 글루타민산 정리의 시간 과정을 분리하는 데 사용할 수있는 실험 및 분석 방법에 대해 설명합니다. 여기에 설명 된 방법은 수명 (을)를 추정하는 데 사용할 수 있습니다F 플래시 uncaged 건강과 질병 동안 중추 신경계의 지역에서 성상 세포 막에 글루타민산 시냅스 발표.
Introduction
성상 세포는 별 모양의 형태와 neuropil를 통해 확장하고 이웃 시냅스 연락처 1,2에 도달 미세 막 돌기 두뇌에있는 가장 풍부한 세포 유형 중 하나입니다. 성상 '세포막 밀도가 글루타민산 염 수송 분자 3로 포장된다. 생리적 조건, 글루타민산 염 수송 빠르게 막 세포 측면에서 글루타민산 염을 바인딩하고 세포의 세포질에 전송할 수 있습니다. 이렇게함으로써, 수송은 세포 공간 4 글루타민산 낮은 기저 농도를 유지한다. 시냅스를 흥분성에 인접 좋은 성상 과정에서 글루타민산 염 수송은 이상적으로는 멀리 시냅스에서의 확산으로 시냅스 이벤트 기간 동안 출시 된 글루타메이트를 바인딩 할 수있는 좋은 위치에 있습니다. 이렇게하면, 전송기는 흥분성 신호의 공간적 확산을 감소 요정 여분의 시냅스 지역을 향해와 인근 시냅스 위에 글루타민산 유출을 제한5-7 뇌의.
글루타민산 염 수송 화학 양 론적 3의 움직임에 결합 electrogenic 과정 나 + 1 H의 자신의 전기 화학적 구배에 따라 + 1 K + 8 반 수송. (안산)> NO 3 – – (질산) ≈ CLO 4 – (과염소산)> I -> 대교 -> 염소 -> F -하지 글루타민산 염 수송은 SCN 투과 (그러나 화학 양 론적으로 결합되지 않음) 음이온 전도성과 연관되어 (메탄 설포 네이트)와 C 6 H 11 O – 7 – (글루 콘 산염) 9-11 CH 3 SO 3. 두 전류 (화학 양론 비 화학 양론) 시각 acut에 Dodt 조명이나 적외선 미분 간섭 대비 (IR-DIC)에서 확인 성상 세포에서 전체 세포 패치 – 클램프 녹음을 획득하여 기록 할 수 있습니다전자 뇌 조각 12. 막에 걸쳐 글루타민산 염 수송과 관련된 현재의 화학 양 론적 구성 요소가 CH 3 SO 3를 사용하여 분리 할 수 있습니다 – 또는 C 6 H 11 O 7 – 기반의 세포 내 솔루션과 성상 세포 13,14에 플래시 uncaging 글루타메이트에 의해 유발 될 수있다, 또는 인접 시냅스에서 글루타메이트 방출을 활성화하여, 하나 전기 12 대상 optogenetic 제어.
운송업자 현재의 화학 양 론적 구성 요소의 시간 과정은 성상 세포 멤브레인 (즉, 글루타민산 통관)에서 글루타메이트 농도 프로파일의 수명에 의해 형성되고, 글루타민산 염 수송, 성상 세포의 수동 막 속성의 동역학, 그리고에 의해 시냅스 자극,시 활성화 된 시냅스 13을 통해 글루타메이트 방출의 동시성. 여기에서 우리는 전체 상세 설명 : (1) 실험 APPR예를 들어 실험 준비로 급성 마우스 해마 슬라이스를 사용하여 성상 세포에서 전체 세포 패치 – 클램프 녹음에서 글루타민산 염 수송 전류의 화학 양 론적 구성 요소를 분리하는 oach (2) 분석 방법은 이러한 기록 13에서 글루타민산 정리의 시간 경과를 파생 14. 이 방법은 기록하고 중추 신경계의 지역에서 성상 세포의 글루타메이트 수송 전류를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 우리가 성상 세포의 전기 생리학 녹음을 얻기 위해 실험 방법을 설명 성상 세포의 글루타메이트 수송 전류를 분리하는 분석 프로토콜에 대한 수학적 방법은 성상 세포 수송 전류에서 글루타민산 정리의 시간 코스를 파생시킵니다.
분석의 성공은 성상 세포에서 고품질의 패치 클램프 녹음을 취득 할 수있는 능력과 수송 전류를 설명하는 데 사용되는 피팅 알고리즘의 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 신경 장애 및 뇌졸중 교내 연구 프로그램 (NS002986)의 국립 연구소에 의해 지원되었다. AS 원고를 쓴 디컨 볼 루션 분석을 구현했습니다. JSD는 디컨 볼 루션 분석의 초기 버전을 개발하고 텍스트에 댓글을 달았습니다.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| CGP52432 | Tocris | 1246 | |
| (R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
| DPCPX | Tocris | 439 | |
| LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
| MSOP | Tocris | 803 | |
| NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
| D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
| Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
| Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
| Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
| Igor Pro 6 | Wavemetrics |
References
- Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
- Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus. Glia. 55, 13-23 (2007).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- Herman, M. A., Jahr, C. E. Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice. J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).
- Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake. Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).
- Barbour, B. An evaluation of synapse independence. J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).
- Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation. J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).
- Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. Flux coupling in a neuronal glutamate transporter. Nature. 383, 634-637 (1038).
- Eliasof, S., Jahr, C. E. Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).
- Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport. Neuron. 15, 721-728 (1995).
- Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel. J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H. Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).
- Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).
- Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina. J. Physiol. 436, 169-193 (1991).
- Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters. J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation. J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).
- Benediktsson, A. M., et al. Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes. Glia. 60, 175-188 (2012).
- Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).
- Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1. J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).
