الكشف عن التعديلات الوراثية الجسدية في عينات الورم عن طريق التقاط اكسون وتسلسلها الموازي واسع
Summary
وصفنا إعداد مكتبات الحمض النووي barcoded واللاحقة المستندة إلى التهجين التقاط اكسون للكشف عن الطفرات المرتبطة بالسرطان الرئيسية في عينات الورم السريرية التي المتوازية "الجيل القادم" التسلسل. استهداف تسلسل اكسون يقدم فوائد إنتاجية عالية وتكلفة منخفضة، وتغطية تسلسل عميق، وبالتالي العائد حساسية عالية للكشف عن الطفرات التردد المنخفض.
Abstract
وقد أثبتت الجهود للكشف والتحقيق الطفرات أنكجنيك مفتاح قيمة لتسهيل العلاج المناسب لمرضى السرطان. إنشاء الإنتاجية العالية، المتوازية "الجيل القادم" التسلسل ساعد على اكتشاف العديد من هذه الطفرات. لتعزيز المرافق السريرية ومتعدية لهذه التكنولوجيا، ويجب أن تكون منصات عالية الإنتاجية، وفعالة من حيث التكلفة، ومتوافقة مع البارافين الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من (FFPE) عينات الأنسجة التي قد تسفر عن كميات صغيرة من الحمض النووي المتدهورة أو التالفة. هنا، نحن تصف إعداد مكتبات الحمض النووي barcoded والمضاعفة تليها التقاط القائم على التهجين من الإكسونات المستهدفة للكشف عن الطفرات المرتبطة بالسرطان في الأورام المجمدة والطازجة FFPE بواسطة تسلسل المتوازية. هذه الطريقة تمكن من تحديد الطفرات تسلسل، نسخ التعديلات العدد، وحدد إعادة ترتيب الهيكلية التي تنطوي على جميع الجينات المستهدفة. استهداف تسلسل اكسون يقدم روقال انه يستفيد من إنتاجية عالية وتكلفة منخفضة، وتغطية تسلسل عميق، وبالتالي منح حساسية عالية للكشف عن الطفرات التردد المنخفض.
Introduction
تحديد "سائق" الأحداث الجينية في الورم المسرطنة الرئيسية وورم القامع الجينات تلعب دورا أساسيا في تشخيص وعلاج العديد من أنواع السرطان 1. وقد مكنت الجهود البحثية على نطاق واسع باستخدام المتوازية "الجيل القادم" التسلسل تحديد الكثير من هذه الجينات المرتبطة بالسرطان في السنوات الأخيرة 2. ومع ذلك، تتطلب هذه المنصات التسلسل عادة كميات كبيرة من الحمض النووي المعزولة من أنسجة الطازجة المجمدة، مما يشكل عائقا كبيرا في تشخيص وتحليل الطفرات الحمض النووي من الأنسجة الحفاظ عليها، مثل البارافين الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من (FFPE) عينات الورم. سوف تحسين الجهود لبكفاءة وبشكل موثوق تميز المعلومات الجينية "للتنفيذ" من عينات الورم FFPE تمكين تحليل بأثر رجعي من العينات المخزنة سابقا، ومواصلة تشجيع النهج الفردي لإدارة السرطان.
تقليديا، د الجزيئيةوقد اعتمدت مختبرات iagnostic على والمنهجيات المنخفضة الإنتاجية تستغرق وقتا طويلا مثل سانجر تسلسل وPCR الوقت الحقيقي لتحديد ملامح طفرة الحمض النووي. وفي الآونة الأخيرة، تم تطوير أساليب إنتاجية أعلى باستخدام PCR المضاعفة أو الطيفي التنميط الجيني الشامل للتحقيق الطفرات الجسدية المتكررة في جينات السرطان الرئيسية 3-5. هذه النهج، ومع ذلك، وتقتصر في ذلك فقط المحددة مسبقا "نقطة ساخنة" الطفرات ويعاير، مما يجعلها غير صالحة للكشف عن الطفرات في الورم تعطيل الجينات القامع. تسلسل المتوازية يقدم العديد من المزايا أكثر من هذه الاستراتيجيات بما في ذلك القدرة على استجواب الإكسونات كامل للطفرات أمر شائع ونادر، والقدرة على الكشف عن الطبقات الإضافية من التعديلات الجيني مثل المكاسب والخسائر في عدد النسخ، وزيادة حساسية الكشف في عينات غير متجانسة 6، 7 . يمثل تسلسل الجينوم كله النهج الأكثر شمولا لاكتشاف طفرة، على الرغم من أنه أمر نسبيويتحمل تكلفة لاي مطالب الحسابية الكبيرة لتحليل البيانات والتخزين.
بالنسبة إلى التطبيقات السريرية، حيث لا يوجد سوى جزء صغير من الجينوم قد تكون ذات فائدة السريرية، كانت اثنين من الابتكارات في مجال التكنولوجيا خاصة التسلسل التحويلية. أولا، من خلال التهجين القائم على التقاط اكسون، يمكن للمرء أن عزل الحمض النووي الموافق الجينات المرتبطة بالسرطان الرئيسية للطفرة التنميط استهدافا 8. ثانيا، من خلال ربط الباركود الجزيئية (أي تسلسل الحمض النووي 6-8 النيوكليوتيدات في الطول)، يمكن للمرء أن تجمع مئات العينات في المدى التسلسل واستفادة الكاملة من قدرة متزايدة من الصكوك تسلسل المتوازية 10. عند الجمع، وهذه الابتكارات تمكين الأورام ليكون موجز لانخفاض تكلفة وأعلى إنتاجية في، مع المتطلبات الحسابية أصغر 11. علاوة على ذلك، من خلال إعادة توزيع التغطية تسلسل فقط تلك الجينات الأكثر أهمية لتطبيق معين، يمكن للمرء achieلقد بمزيد من التعمق تسلسل لأعلى حساسية الكشف عن انخفاض وتيرة الأحداث أليل.
نحن هنا وصفا لدينا IMPACT مقايسة (الطفرة التنميط المتكاملة من الأهداف المنحى السرطان)، الذي يستخدم القبض على اكسون حمامات مكتبة تسلسل barcoded بواسطة التهجين باستخدام [أليغنوكليوتيد مخصصة لالتقاط كل الإكسونات الترميز البروتين وحدد الإنترونات من 279 الجينات المرتبطة بالسرطان الرئيسية (الجدول 1 ). هذه الاستراتيجية تمكن تحديد الطفرات، indels، والتعديلات في عدد النسخ، وحدد إعادة ترتيب الهيكلية التي تنطوي على هذه الجينات 279. أسلوبنا هو متوافق مع الحمض النووي المعزولة من أنسجة سواء الطازجة المجمدة وFFPE وكذلك حرف هاء إبرة دقيقة وعينات الخلايا الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
لدينا IMPACT فحص تنتج نسبة عالية المحاذاة، وارتفاع معدل على الهدف، التغطية المستهدفة عالية، وحساسية عالية للكشف عن الطفرات، indels، ونسخ التعديلات العدد. لقد أثبتنا قدرة لدينا فحص الحمض النووي لIMPACT تسلسل من كلا الطازجة المجمدة وأرشفة عينات الحمض النووي FFPE من المدخلات من?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور أغنيس فيالي ومختبر علم الجينوم MSKCC الأساسية للحصول على المساعدة الفنية. وقد تم تطوير هذا البروتوكول بدعم من مركز أبحاث السرطان Beene جيفري ومؤسسة مزارع العائلة.
Materials
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
References
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
- Thomas, R. K., Baker, A. C., Debiasi, R. M., et al. High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer. Nat. Genet. 39 (3), 347-351 (2007).
- Macconaill, L. E., Campbell, C. D., Kehoe, S. M., et al. Profiling critical cancer gene mutations in clinical tumor samples. PLoS One. 4 (11), e7887 (2009).
- Dias-Santagata, D., Akhavanfard, S., David, S. S., et al. Rapid targeted mutational analysis of human tumours: a clinical platform to guide personalized cancer medicine. EMBO Mol. Med. 2 (5), 146-158 (2010).
- Macconaill, L. E., Van Hummelen, P., Meyerson, M., Hahn, W. C. Clinical implementation of comprehensive strategies to characterize cancer genomes: opportunities and challenges. Cancer Discov. 1 (4), 297-311 (2011).
- Taylor, B. S., Ladanyi, M. Clinical cancer genomics: how soon is now. J. Pathol. 223 (2), 318-326 (2011).
- Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat. Biotechnol. 27 (2), 182-189 (2009).
- Mamanova, L., Coffey, A. J., Scott, C. E., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat. Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Craig, D. W., Pearson, J. V., Szelinger, S., et al. Identification of genetic variants using bar-coded multiplexed sequencing. Nat. Methods. 5 (10), 887-893 (2008).
- Wagle, N., Berger, M. F., Davis, M. J., et al. High-throughput detection of actionable genomic alterations in clinical tumor samples by targeted, massively parallel sequencing. Cancer Discov. 2 (1), 82-93 (2012).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Depristo, M. A., Banks, E., Poplin, R., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat. Genet. 43 (5), 491-498 (2011).
- Robinson, J. T., Thorvaldsdottir, H., Winckler, W., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Cibulskis, K., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
- Larson, D. E., Harris, C. C., Chen, K., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
- Saunders, C. T., Wong, W. S., Swamy, S., Becq, J., Murray, L. J., Cheetham, R. K. Strelka: Accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
- Albers, C. A., Lunter, G., Macarthur, D. G., Mcvean, G., Ouwehand, W. H., Din del Durbin, R. Accurate indel calls from short-read data. Genome Res. 21 (6), 961-973 (2011).
- Li, S., Li, R., Li, H., et al. Efficient identification of indels from short paired reads. Genome Res. 23 (1), 195-200 (2013).
- Sindi, S., Helman, E., Bashir, A., Raphael, B. J. A geometric approach for classification and comparison of structural variants. Bioinformatics. 25 (12), 222-230 (2009).
- Chen, K., Wallis, J. W., Mclellan, M. D., et al. BreakDancer: an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation. Nat. Methods. 6 (9), 677-681 (2009).
- Wang, J., Mullighan, C. G., Easton, J., et al. CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution. Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).
- Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability. Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study. Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).
- Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity. BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).
