エクソンキャプチャと超並列配列決定することにより腫瘍標本における体細胞遺伝子変異を検出する
Summary
我々は、超並列「次世代」配列決定による臨床腫瘍標本における主要癌関連変異の検出のためのバーコードDNAライブラリーおよびその後のハイブリダイゼーションに基づくエクソンキャプチャの製造を記載している。標的エクソン配列決定は、低周波の変異を検出するための高感度を得、高スループット、低コスト、かつ深い配列カバーの利点を提供しています。
Abstract
重要な発癌性変異を検出し、調査するための努力は、癌患者のための適切な治療を容易にするために貴重であることが分かっている。高スループットの設立は、超並列」の次世代「シングは、多くのこのような変異の発見を支援しています。この技術の臨床およびトランスレーショナル有用性を高めるために、プラットフォームは、高スループット、費用対効果の高い、劣化したり損傷したDNAの少量をもたらすことがあり、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織サンプルとの互換性が必要です。ここでは、超並列配列決定による新鮮凍結およびFFPE腫瘍中の癌関連変異の検出対象エクソンのハイブリダイゼーションに基づく捕獲に続いてバーコードと多重化されたDNAライブラリーの調製を記載している。このメソッドは、シーケンスの変異の同定を可能にする数の変化をコピーし、すべての標的遺伝子が関与する構造的な再編成を選択します。標的エクソン配列決定は、Tを提供しています彼は、このように低周波変異を検出するための高感度を与える、高スループット、低コスト、深い配列カバーの特典。
Introduction
主要な癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子における「運転者」とは、腫瘍遺伝的事象の同定は、多くの癌1の診断および治療 において重要な役割を果たしている。超並列"次世代"シーケンシングを利用した大規模な研究努力が、近年2にこのような多くの癌関連遺伝子の同定を可能にしてきた。しかし、これらのシーケンシングプラットフォームは、通常、腫瘍サンプル（FFPE）このように、埋め込みホルマリン固定パラフィンとして保存組織からのDNAの変異を特徴づけると分析する主要な制限を装った、新鮮な凍結組織から単離したDNAを大量に必要とする。効率的かつ確実にFFPE腫瘍サンプルから「実用的な「ゲノム情報を特徴づける、改善の努力は、以前にバンク標本のレトロスペクティブ分析を可能にし、さらに癌管理の個別化されたアプローチを奨励する。
伝統的に、分子Diagnostic研究室は、このようなDNA変異プロファイリングのためのサンガー配列決定およびリアルタイムPCRのような時間がかかり、低スループット手法に頼ってきた。より最近では、多重化PCRまたは質量分析遺伝子型決定を用いた高スループット法は、キー癌遺伝子3-5に再発性の体細胞変異を調査するために開発されてきた。これらのアプローチは、しかしながら、腫瘍抑制遺伝子における不活性化変異を検出するため、それらを不適切にする、唯一の予め指定された「ホットスポット」の突然変異をアッセイすることを制限される。超並列シーケンシングは、一般的で珍しいの両方の突然変異のために全体のエクソンを尋問する能力などのコピー数の差損益などのゲノム変化の追加クラスを明らかにする能力、および異機種のサンプル6においてより検出感度を含め、これらの戦略に比べていくつかの利点を提供しています7 。それは相対的でありながら、全ゲノム配列決定は、突然変異の発見のための最も包括的なアプローチであるLY高価であり、データ分析および記憶のための大きな計算要求を招く。
ゲノムのごく一部が臨床興味のある臨床用途については、シークエンシング技術の2つの特定の技術革新は、変形可能となっている。まず、ハイブリダイゼーションに基づくエクソンキャプチャを通じて、1は、標的変異プロファイリング8のキー癌関連遺伝子に対応するDNAを単離することができる。第二に、分子バーコード（ つまり、DNA配列の長さは6〜8ヌクレオチド）の連結を通じて、1は、配列決定の実行あたりのサンプル数百のプールができ、完全に大規模並列シーケンシング機器10の増え続ける能力を活用しています。組み合わせることで、これらの技術革新は、より小さな計算要件11と、低コストで、より高いスループットでプロファイルするために腫瘍を可能にする。さらに、特定のアプリケーションに最も重要な遺伝子のみにシーケンスカバレッジを再分配することで、1はachieでき低アレル頻度イベントのより高い検出感度を大きくシング深さを見る。
ここでは、 表1（全タンパク質コードエクソンをキャプチャし、279キー、癌関連遺伝子のイントロンを選択するためのカスタムオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションにより、バーコード配列ライブラリプールのエクソンキャプチャを利用したライオンズのインパクト分析（アクショナブル癌標的の統合変異プロファイリング）を記述する）。この戦略は、変異が、インデル、コピー数変化の識別を可能にし、これらの279の遺伝子が関与する構造的な再編成を選択します。我々の方法は、新鮮凍結およびFFPE組織だけでなく、細針吸引やその他の細胞診標本の両方から単離されたDNAと互換性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
ライオンズのインパクト分析は、高いアライメント率、高いオンターゲット率、高い目標をカバーし、変異を検出するための高感度を生産インデル、および数の変化をコピーします。我々は低DNA入力の新鮮凍結およびアーカイブFFPEサンプルの両方から配列DNAにライオンズのインパクト分析の能力を実証した。重要な癌関連遺伝子の標的エクソンのシークエンシングを行うことにより、人はそ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は技術支援のために博士アグネスヴィアーレとMSKCCゲノミクスコア研究室に感謝します。このプロトコルは、ジェフリーBeeneがん研究センターとファーマーファミリー財団の支援を受けて開発されました。
Materials
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
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