Detectando somáticas Genéticos Alterações em amostras de tumor por Exon Captura e Seqüenciamento Massively Parallel
Summary
Nós descrevemos a preparação de bibliotecas de DNA com código de barras e posterior captura exon baseada em hibridização para a detecção de mutações associadas ao câncer de chave em amostras de tumor clínicos por sequenciamento paralelo em massa "próxima geração". Alvejado seqüenciamento exon oferece os benefícios de alto rendimento, baixo custo, e cobertura seqüência de profundidade, proporcionando assim alta sensibilidade para detecção de mutações de baixa frequência.
Abstract
Os esforços para detectar e investigar mutações oncogênicas chave provaram valiosos para facilitar o tratamento adequado para pacientes com câncer. O estabelecimento de alto rendimento, massivamente paralelo sequenciamento "de última geração" tem ajudado a descoberta de muitas dessas mutações. Para aumentar a utilidade clínica e de translação desta tecnologia, as plataformas devem ser de alto rendimento, custo-benefício, e compatível com parafina fixado em formalina incorporado (FFPE) amostras de tecido que podem render pequenas quantidades de DNA degradado ou danificado. Aqui, descrevemos a preparação de bibliotecas de DNA com código de barras e multiplexados seguidos de captura baseada em hibridização de exons direcionados para a detecção de mutações associadas ao câncer em tumores congelados e frescos FFPE por sequenciamento paralelo em massa. Este método permite a identificação de mutações de seqüência, copiar alterações numéricas e selecionar rearranjos estruturais envolvendo todos os genes-alvo. Alvejado seqüenciamento exon oferece tele beneficia de alto rendimento, baixo custo, e cobertura seqüência profundo, conferindo, assim, alta sensibilidade para detecção de mutações de baixa frequência.
Introduction
A identificação de eventos genéticos tumorais "driver" em oncogenes chave e genes supressores de tumor tem um papel fundamental no diagnóstico e no tratamento de muitos tipos de câncer 1. Esforços de pesquisa em larga escala utilizando sequenciamento paralelo em massa "de última geração" permitiram a identificação de muitos desses genes associados ao câncer nos últimos anos 2. No entanto, essas plataformas de sequenciamento exigem tipicamente grandes quantidades de DNA isoladas de tecidos congelados frescos, representando, assim, uma grande limitação na caracterização e análise de mutações de DNA de tecidos conservados, como a parafina fixado em formalina incorporado (FFPE) amostras tumorais. Melhoria esforços eficiente e confiável para caracterizar a informação genômica "acionáveis" a partir de amostras de tumores FFPE permitirá a análise retrospectiva de espécimes previamente inclinadas e ainda incentivar abordagens individualizadas para tratamento de câncer.
Tradicionalmente, d molecularlaboratórios iagnostic têm contado com metodologias baixo rendimento demoradas, como sequenciamento Sanger e PCR em tempo real para a mutação do DNA profiling. Mais recentemente, métodos de maior rendimento, utilizando PCR multiplexada ou genotipagem de espectrometria de massa foram desenvolvidos para investigar mutações somáticas recorrentes nos genes chave do cancro 3-5. Estas tentativas, no entanto, são limitadas na medida em que apenas predeterminados "ponto quente" mutações são ensaiadas, tornando-os inadequados para a detecção de mutações de inactivação nos genes supressores tumorais. Sequenciamento paralelo em massa oferece várias vantagens em relação a estas estratégias, incluindo a capacidade de interrogar exons inteiros de mutações comuns e raros, a capacidade de revelar classes adicionais de alterações genômicas, tais como os ganhos e perdas no número de cópias, e maior sensibilidade de detecção em amostras heterogêneas 6, 7 . Seqüenciamento do genoma inteiro representa a abordagem mais abrangente para a descoberta da mutação, embora seja relativaly caro e incorre em grandes demandas computacionais para análise e armazenamento de dados.
Para aplicações clínicas, onde apenas uma pequena fração do genoma podem ser de interesse clínico, duas inovações específicas em tecnologia de seqüenciamento foram transformadora. Primeiro, através baseada em hibridização captura exon, pode-se isolar o DNA correspondente a genes-chave associados ao câncer de profiling mutação alvejado 8. Em segundo lugar, através da ligadura de códigos de barras molecular (ou seja, seqüências de DNA 6-8 nucleotídeos de comprimento), pode-se reunir centenas de amostras por sequenciamento de correr e aproveitar plenamente a capacidade cada vez maior de instrumentos de seqüenciamento de massivamente paralelo 10. Quando combinadas, estas inovações permitem que os tumores de ser perfilado para menor custo e com maior rendimento, com menores exigências computacionais 11. Além disso, através da redistribuição de cobertura de sequência com apenas os genes mais importantes para a aplicação particular, pode-se Achieve maior profundidade seqüenciamento de maior sensibilidade de detecção de eventos de baixa freqüência do alelo.
Aqui nós descrevemos nosso ensaio IMPACT (Integrated Mutação Profiling de Metas Câncer acionável), que utiliza a captura de código de barras no exon piscinas biblioteca seqüência por hibridização com oligonucleotídeos personalizados para capturar todos os exons codificadores de proteínas e selecione íntrons de 279 genes-chave associados ao câncer (Tabela 1 ). Esta estratégia permite a identificação de mutações, indels, alterações no número de cópias e selecione rearranjos estruturais envolvendo estes 279 genes. O nosso método é compatível com o DNA isolado a partir de ambos os tecidos congelados frescos e FFPE, bem como aspirados por agulhas finas e outros espécimes citológicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nosso ensaio IMPACTO produz uma alta taxa de alinhamento, de alta taxa de on-alvo, cobertura alvo elevado e alta sensibilidade para detecção de mutações, indels e copiar alterações numéricas. Nós demonstramos a capacidade de nosso ensaio IMPACTO a seqüência de DNA de ambos fresco congelado e arquivados amostras FFPE de entrada de baixa DNA. Ao realizar o seqüenciamento exon alvo de genes-chave associados ao câncer, pode-se atingir a cobertura seqüência muito profundo para os exons desses genes mais crític…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Agnes Viale eo MSKCC Genomics Laboratory Núcleo para assistência técnica. Este protocolo foi desenvolvido com o apoio do Centro de Pesquisa do Câncer Geoffrey Beene e da Fundação Agricultor Familiar.
Materials
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
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