Мы описывают получение штрих библиотек ДНК и последующей гибридизации на основе захвата экзона для обнаружения ключевых связанных с раком мутаций в клинических образцах опухолей по массовым параллелизмом секвенирования "следующего поколения". Целевые экзон последовательности предлагает преимущества высокой пропускной способности, низкой стоимости и глубокой покрытия последовательности, что позволит обеспечить высокую чувствительность для обнаружения низкие мутации частот.
Усилия по выявлению и расследованию ключевые онкогенные мутации оказались ценными для облегчения соответствующее лечение для больных раком. Установление высокой пропускной, массовым параллелизмом последовательности "следующего поколения" помог открытие многих таких мутаций. Для повышения клинической и поступательное полезность этой технологии, платформы должны быть высокой пропускной, экономически эффективной, и совместимо с формалином фиксированной парафин (FFPE) образцы тканей, которые могут дать малое количество деградированных или поврежденной ДНК. Здесь мы описываем подготовку штрих и мультиплексированных библиотек ДНК с последующей гибридизацией на основе захвата целевых экзонов для обнаружения связанных с раком мутаций в свежезамороженных и FFPE опухолей по массовым параллелизмом секвенирования. Этот метод позволяет выявить мутации последовательности, скопируйте номер изменения, и выберите структурные перестройки с участием всех целевых генов. Целевые экзон последовательности предлагает тон приносит пользу высокой пропускной способности, низкой стоимости и глубокой покрытия последовательности, таким образом, присвоении высокой чувствительностью для обнаружения низкие мутации частот.
Идентификация "водитель" опухолевых генетических событий в ключевых онкогенов и генов-супрессоров опухолей играет существенную роль в диагностике и лечении многих видов рака 1. Крупномасштабные научно-исследовательских работ, использующие массовым параллелизмом последовательности "следующего поколения", позволили выявить многих таких раковых генов, ассоциированных в последние годы 2. Тем не менее, эти платформы секвенирования как правило, требуют больших количеств ДНК, выделенные из свежезамороженных тканей, что создает серьезную проблему, при характеристике и анализа мутаций ДНК из сохранившихся тканей, таких как фиксированные формалином и залитые парафином (FFPE) образцов опухолей. Улучшенные усилия для эффективного и надежного характеризуют "действенные" геномной информации из образцов опухолевых FFPE позволит ретроспективный анализ ранее накренился образцов и далее поощрять индивидуальные подходы к лечению рака.
Традиционно, молекулярная гiagnostic лаборатории полагались на трудоемких, с низким уровнем пропускной методологий, таких как Sanger секвенирования и ПЦР в реальном времени для мутаций ДНК профилирования. Совсем недавно, методы выше пропускной использующие мультиплексированный ПЦР или масс-спектрометрический генотипирование были разработаны, чтобы исследовать текущие соматические мутации в ключевых генов рака 3-5. Эти подходы, однако, ограничиваются тем, что только predesignated "горячих точек" мутации анализировали, что делает их непригодными для обнаружения инактивирующие мутации в генах супрессоров опухолей. Солидная параллельная последовательность предлагает несколько преимуществ по сравнению с этих стратегий, включая возможность запрашивать целые экзоны для обоих распространенных и редких мутаций, возможность выявления дополнительных классов геномных изменений, таких как число копий прибылей и убытков, а также большей чувствительностью обнаружения в гетерогенных образцов 6, 7 . Всего секвенирование генома представляет собой наиболее комплексный подход к открытию мутации, хотя это относительнолы дорогой и несет большие вычислительные мощности для анализа и хранения данных.
Для клинического применения, где только небольшая часть генома могут представлять клинический интерес, два конкретных инновации в технологии последовательности были преобразующей. Во-первых, через гибридизации на основе захвата экзона, можно выделить ДНК, соответствующий ключевых связанных с раком генов целевой мутации профилирования 8,. Во-вторых, через перевязкой молекулярных штрих-кодов (т.е. последовательности ДНК 6-8 нуклеотидов в длину), можно объединить сотни образцов в секвенирования перспективе и полностью воспользоваться все возрастающей мощностью массовым параллелизмом инструментов секвенирования 10. В сочетании, эти нововведения позволяют опухоли для профилирования для более низкой стоимости и в более высокой пропускной способности, с меньшими вычислительными требованиями 11. Кроме того, путем перераспределения покрытие только последовательности этих генов наиболее важных для конкретного применения, можно достижимве большую глубину секвенирования повышенной чувствительностью обнаружения для низких событий частот аллелей.
Здесь мы опишем наше воздействие анализа (Integrated Мутация профилирования мишеней Осуществимое рака), которая использует захват экзона на штрих бассейнов библиотечных последовательность путем гибридизации с использованием пользовательских олигонуклеотиды, чтобы захватить все белок-кодирующих экзонов и выберите интронов из 279 ключевых раковых генов, ассоциированных (Таблица 1 ). Эта стратегия позволяет выявить мутации, вставкам, количество копию изменений и выберите структурные перестройки, связанные с эти 279 генов. Наш метод совместим с ДНК, выделенной из обоих свежезамороженной и FFPE ткани, а также мелких аспиратов игл и других цитологических образцов.
Наша ВЛИЯНИЕ анализ производит высокую скорость выравнивания, высокую ставку по-цели, высокую целевую охват и высокую чувствительность для обнаружения мутаций, вставкам и скопировать номер изменения. Мы продемонстрировали способность нашего IMPACT анализе для последовательности ДНК и?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим доктора Агнес Виале и центральной лаборатории MSKCC геномики для технической помощи. Этот протокол был разработан при поддержке Бин онкологический научный центр Джеффри и Фермер Семейства.
NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
Covaris E220 | Covaris | ||
Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |