La detección de alteraciones genéticas somáticas en muestras de tumores por Exon de captura y secuenciación masivamente paralelo
Summary
Se describe la preparación de bibliotecas de ADN con códigos de barras y la posterior basada en la hibridación exón captura para la detección de mutaciones clave asociados con el cáncer en las muestras tumorales clínicos de secuenciación masiva en paralelo de "próxima generación". Targeted secuenciación exón ofrece los beneficios de alto rendimiento, bajo coste, y la cobertura de secuencia profunda, produciendo de este modo una alta sensibilidad para la detección de mutaciones de baja frecuencia.
Abstract
Los esfuerzos para detectar e investigar las mutaciones oncogénicas clave han demostrado su utilidad para facilitar el tratamiento adecuado para los pacientes con cáncer. El establecimiento de alto rendimiento, la secuenciación masiva en paralelo "de nueva generación" ha ayudado al descubrimiento de muchas de estas mutaciones. Para aumentar la utilidad clínica y traslacional de esta tecnología, las plataformas deben ser de alto rendimiento, rentable y compatible con parafina fijado en formol e incrustados (FFPE) muestras de tejido que pueden producir pequeñas cantidades de ADN degradado o dañado. Aquí se describe la preparación de bibliotecas de ADN con códigos de barras y multiplexados seguido de captura basados en la hibridación de los exones específicos para la detección de mutaciones asociadas con el cáncer en los tumores congelados y frescos por FFPE secuenciación masiva en paralelo. Este método permite la identificación de mutaciones en la secuencia, copia alteraciones numéricas y seleccionar reajustes estructurales que involucran todos los genes específicos. Targeted secuenciación del exón ofrece tse beneficia de un alto rendimiento, bajo costo, y la cobertura de secuencia de profundidad, lo que confiere una alta sensibilidad para la detección de mutaciones de baja frecuencia.
Introduction
La identificación de "conductor" eventos genéticos tumorales en oncogenes clave y genes supresores de tumores juega un papel esencial en el diagnóstico y el tratamiento de muchos tipos de cáncer 1. Los esfuerzos de investigación a gran escala que utilizan la secuenciación masiva en paralelo "de nueva generación" han permitido la identificación de muchos de estos genes asociados con el cáncer en los últimos años 2. Sin embargo, estas plataformas de secuenciación típicamente requieren grandes cantidades de ADN aisladas a partir de tejidos congelados frescos, lo que plantea una limitación importante en la caracterización y análisis de mutaciones de ADN de tejidos conservados, tales como parafina fijado con formalina incrustado (FFPE) muestras de tumor. La mejora de los esfuerzos para caracterizar de manera eficiente y confiable de la información genómica "recurribles" de muestras de tumores FFPE permitirán el análisis retrospectivo de muestras previamente caballones y seguir fomentando enfoques individualizados para el manejo del cáncer.
Tradicionalmente, d molecularlaboratorios iagnostic se han basado en metodologías de bajo rendimiento que requieren mucho tiempo, como la secuenciación de Sanger y PCR en tiempo real para el perfil de mutación del ADN. Más recientemente, los métodos de mayor rendimiento que utilizan PCR multiplexada o determinación del genotipo de espectrometría de masas se han desarrollado para investigar mutaciones somáticas recurrentes en los genes del cáncer clave 3-5. Estos enfoques, sin embargo, están limitados en que sólo las mutaciones predesignadas "punto caliente" se ensayan, que los hace inadecuados para la detección de mutaciones inactivadoras en los genes supresores de tumores. Secuenciación masiva en paralelo ofrece varias ventajas con respecto a estas estrategias que incluyen la posibilidad de interrogar a los exones enteros para las mutaciones tanto comunes como poco frecuentes, la capacidad de revelar las clases adicionales de alteraciones genómicas tales como las ganancias y pérdidas de número de copias, y una mayor sensibilidad de detección en muestras heterogéneas 6, 7 . La secuenciación del genoma entero representa el enfoque más completo para el descubrimiento de la mutación, aunque es relativamente costoso y incurre grandes demandas computacionales para el análisis y el almacenamiento de datos.
Para aplicaciones clínicas, en los que sólo una pequeña fracción del genoma puede ser de interés clínico, dos innovaciones particulares en la tecnología de secuenciación han sido transformadora. En primer lugar, a través de la hibridación con sede en el exón captura, se puede aislar el ADN correspondiente a los genes clave asociados con el cáncer de apuntado perfiles mutación 8,. En segundo lugar, a través de la ligadura de los códigos de barras moleculares (es decir, secuencias de ADN de 6-8 nucleótidos de longitud), se puede agrupar cientos de muestras por corrida secuenciación y aprovechar al máximo la capacidad cada vez mayor de instrumentos de secuenciación masivamente paralelo 10. Cuando se combinan, estas innovaciones permiten que los tumores ser perfilado para un menor coste y con mayor rendimiento, con requisitos de cómputo más pequeños 11. Además, mediante la redistribución de la cobertura de secuencia de sólo los genes más importantes para la aplicación particular, uno puede ACHIEve más a fondo la secuenciación para una mayor sensibilidad de detección para eventos de baja frecuencia de los alelos.
Aquí describimos nuestro ensayo IMPACT (Integrated Mutación de perfiles de objetivos de cáncer Actionable), que utiliza la captura de códigos de barras en el exón piscinas biblioteca secuencia mediante hibridación utilizando oligonucleótidos personalizados para capturar todos los exones codificadores de proteínas y seleccione intrones de 279 genes claves asociados con el cáncer (Tabla 1 ). Esta estrategia permite la identificación de mutaciones, indeles, alteraciones del número de copias y seleccione reajustes estructurales que implican estos 279 genes. Nuestro método es compatible con el ADN aislado de tanto tejido congelado y FFPE fresca, así como aspirados con aguja fina y otras muestras de citología.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro ensayo IMPACT produce una alta tasa de alineación, la alta tasa en el blanco, la meta de cobertura alta, y alta sensibilidad para detectar mutaciones, indeles y copiar alteraciones numéricas. Hemos demostrado la capacidad de nuestro ensayo IMPACT secuencia de ADN de ambos helado en fresco y archivado muestras de FFPE de entrada de baja ADN. Mediante la realización de secuenciación dirigida exón de los genes clave asociados con el cáncer, se puede lograr una cobertura de secuencia muy profundo para los exon…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a la Dra. Agnes Viale y el Laboratorio de Genómica MSKCC para la asistencia técnica. Este protocolo ha sido desarrollado con el apoyo del Centro de Investigación del Cáncer Geoffrey Beene y la Fundación Agricultores familia.
Materials
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
References
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
- Thomas, R. K., Baker, A. C., Debiasi, R. M., et al. High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer. Nat. Genet. 39 (3), 347-351 (2007).
- Macconaill, L. E., Campbell, C. D., Kehoe, S. M., et al. Profiling critical cancer gene mutations in clinical tumor samples. PLoS One. 4 (11), e7887 (2009).
- Dias-Santagata, D., Akhavanfard, S., David, S. S., et al. Rapid targeted mutational analysis of human tumours: a clinical platform to guide personalized cancer medicine. EMBO Mol. Med. 2 (5), 146-158 (2010).
- Macconaill, L. E., Van Hummelen, P., Meyerson, M., Hahn, W. C. Clinical implementation of comprehensive strategies to characterize cancer genomes: opportunities and challenges. Cancer Discov. 1 (4), 297-311 (2011).
- Taylor, B. S., Ladanyi, M. Clinical cancer genomics: how soon is now. J. Pathol. 223 (2), 318-326 (2011).
- Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat. Biotechnol. 27 (2), 182-189 (2009).
- Mamanova, L., Coffey, A. J., Scott, C. E., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat. Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Craig, D. W., Pearson, J. V., Szelinger, S., et al. Identification of genetic variants using bar-coded multiplexed sequencing. Nat. Methods. 5 (10), 887-893 (2008).
- Wagle, N., Berger, M. F., Davis, M. J., et al. High-throughput detection of actionable genomic alterations in clinical tumor samples by targeted, massively parallel sequencing. Cancer Discov. 2 (1), 82-93 (2012).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Depristo, M. A., Banks, E., Poplin, R., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat. Genet. 43 (5), 491-498 (2011).
- Robinson, J. T., Thorvaldsdottir, H., Winckler, W., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Cibulskis, K., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
- Larson, D. E., Harris, C. C., Chen, K., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
- Saunders, C. T., Wong, W. S., Swamy, S., Becq, J., Murray, L. J., Cheetham, R. K. Strelka: Accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
- Albers, C. A., Lunter, G., Macarthur, D. G., Mcvean, G., Ouwehand, W. H., Din del Durbin, R. Accurate indel calls from short-read data. Genome Res. 21 (6), 961-973 (2011).
- Li, S., Li, R., Li, H., et al. Efficient identification of indels from short paired reads. Genome Res. 23 (1), 195-200 (2013).
- Sindi, S., Helman, E., Bashir, A., Raphael, B. J. A geometric approach for classification and comparison of structural variants. Bioinformatics. 25 (12), 222-230 (2009).
- Chen, K., Wallis, J. W., Mclellan, M. D., et al. BreakDancer: an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation. Nat. Methods. 6 (9), 677-681 (2009).
- Wang, J., Mullighan, C. G., Easton, J., et al. CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution. Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).
- Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability. Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study. Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).
- Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity. BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).
