Upptäcka Somatiska genetiska förändringar i tumörprover från Exon Capture och Massively Parallel sekvense
Summary
Vi beskriver framställningen av streckkodade DNA-bibliotek och efterföljande hybridisering-baserade exon fånga för detektion av viktiga cancerassocierade mutationer i kliniska tumörprover av massivt parallella "nästa generations" sekvensering. Riktad exon sekvense erbjuder fördelarna med hög genomströmning, låg kostnad, och djup sekvenstäckning, vilket således ger hög känslighet för att detektera lågfrekventa mutationer.
Abstract
Arbetet med att upptäcka och utreda viktiga onkogena mutationer har visat sig vara värdefullt för att underlätta lämplig behandling för cancerpatienter. Inrättandet av hög genomströmning, har massivt parallell "nästa generations" sekvense hjälp upptäckten av många sådana mutationer. För att förbättra den kliniska och translationell nytta av denna teknik, måste plattformar vara hög genomströmning, kostnadseffektiv, och kompatibel med formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) vävnadsprover som kan ge små mängder degraderad eller skadat DNA. Här beskriver vi framställningen av streckkodade och multiplexade DNA-bibliotek följt av hybridisering baserat infångande av målinriktade exoner för påvisande av cancerassocierade mutationer i färska frysta och FFPE tumörer genom massivt parallell sekvensering. Denna metod gör det möjligt att identifiera sekvens mutationer, kopiera antal förändringar, och väljer strukturella omorganiseringar som omfattar alla riktade gener. Riktad exon sekvense erbjuder than nytta av hög kapacitet, låg kostnad, och djupa sekvenstäckning, vilket ger hög känslighet för att detektera lågfrekventa mutationer.
Introduction
Identifieringen av "förare" tumör genetiska händelser i centrala onkogener och tumörsuppressorgener spelar en viktig roll vid diagnos och behandling av många cancerformer 1. Storskaliga forskningsinsatser som utnyttjar massivt parallella "nästa generations" sekvensering har gjort det möjligt att identifiera många sådana cancerassocierade gener under de senaste åren 2. Men dessa sekvense plattformar kräver normalt stora mängder av DNA som isolerats från färska frusna vävnader, och de utgör en stor begränsning vid karakterisering och analys av DNA-mutationer från bevarade vävnader, såsom formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) tumörprover. Förbättrade insatser för att på ett effektivt och tillförlitligt sätt kännetecknar "actionable" genomisk information från FFPE tumörprover kommer att möjliggöra retrospektiv analys av tidigare bankas exemplar och ytterligare uppmuntra individualiserade metoder för cancervården.
Traditionellt molekylär diagnostic laboratorier har förlitat sig på tidskrävande, låg genomströmning metoder såsom Sanger-sekvensering och realtids-PCR för DNA mutation profilering. På senare tid har högre genomströmning metoder som utnyttjar multiplex PCR eller masspektrometrisk genotypning utvecklats för att undersöka återkommande somatiska mutationer i viktiga cancergener 3-5. Dessa tillvägagångssätt är emellertid begränsat i det att endast förutbestämd "hotspot"-mutationer analyseras, vilket gör dem olämpliga för detektering av inaktiverande mutationer i tumörsuppressorgener. Massivt parallella sekvense erbjuder flera fördelar jämfört med dessa strategier inklusive möjligheten att förhöra hela exoner för både vanliga och sällsynta mutationer, förmågan att avslöja ytterligare klasser av genomiska förändringar såsom kopierings antal vinster och förluster, samt större känslighet upptäckt i heterogena prover 6, 7 . Hela genomet sekvensering är den mest heltäckande strategi för mutation upptäckt, även om det är relativtly dyrt och medför stora beräknings krav på dataanalys och förvaring.
För kliniska tillämpningar, där endast en liten del av genomet kan vara av kliniskt intresse har två särskilda innovationer i sekvenseringsteknologi varit omvälvande. Först genom hybridisering-baserade exon fånga, kan man isolera DNA som motsvarar viktiga cancerassocierade gener för riktad mutation profilering 8. För det andra, genom ligering av molekylära streckkoder (dvs. DNA-sekvenser 6-8 nukleotider i längd), kan man samla hundratals prover per sekvense kör och fullt ut dra nytta av den ständigt ökande kapacitet på massivt parallella sekvenseringsinstrument 10. Sammantagna visar dessa innovationer möjliggör tumörer som ska profileras för lägre kostnad och med högre kapacitet, med mindre beräknings krav 11. Vidare, genom att omfördela sekvenstäckning till endast de gener som mest kritiska för den speciella applikationen, kan en achieve större sekvense djup för högre känslighet för låga händelser allelfrekvens upptäckt.
Här beskriver vi vår IMPACT-analys (Integrated Mutation Profilering av Actionable cancer mål), som utnyttjar exon fånga på streckkodade sekvens bibliotekspooler genom hybridisering med hjälp av anpassade oligonukleotider att fånga alla protein-kodande exoner och väljer introner av 279 nyckelcancerassocierade gener (Tabell 1 ). Denna strategi gör det möjligt att identifiera mutationer, indels, antal kopior förändringar, och väljer strukturella omorganiseringar som involverar dessa 279 gener. Vår metod är kompatibel med DNA isolerat från både fryst och FFPE vävnad samt fina nål aspirat och andra cytologiprover.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår IMPACT-analysen ger en hög anpassning hastighet, hög på målnivån, höga mål täckning och hög känslighet för detektion av mutationer, indels, och antalet exemplar förändringar. Vi har visat förmågan att vår IMPACT-analys till sekvens DNA från både fryst och arkiveras FFPE prover av låg DNA-ingång. Genom att utföra riktade exon sekvensering av viktiga cancerassocierade gener, kan man uppnå mycket djup sekvenstäckning för exoner av dessa mest kritiska gener och därigenom maximera förmågan att…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Agnes Viale och MSKCC Genomics Core-laboratoriet för teknisk assistans. Detta protokoll har utvecklats med stöd från Geoffrey Beene Cancer Research Center och Farmer Family Foundation.
Materials
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
References
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
- Thomas, R. K., Baker, A. C., Debiasi, R. M., et al. High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer. Nat. Genet. 39 (3), 347-351 (2007).
- Macconaill, L. E., Campbell, C. D., Kehoe, S. M., et al. Profiling critical cancer gene mutations in clinical tumor samples. PLoS One. 4 (11), e7887 (2009).
- Dias-Santagata, D., Akhavanfard, S., David, S. S., et al. Rapid targeted mutational analysis of human tumours: a clinical platform to guide personalized cancer medicine. EMBO Mol. Med. 2 (5), 146-158 (2010).
- Macconaill, L. E., Van Hummelen, P., Meyerson, M., Hahn, W. C. Clinical implementation of comprehensive strategies to characterize cancer genomes: opportunities and challenges. Cancer Discov. 1 (4), 297-311 (2011).
- Taylor, B. S., Ladanyi, M. Clinical cancer genomics: how soon is now. J. Pathol. 223 (2), 318-326 (2011).
- Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat. Biotechnol. 27 (2), 182-189 (2009).
- Mamanova, L., Coffey, A. J., Scott, C. E., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat. Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Craig, D. W., Pearson, J. V., Szelinger, S., et al. Identification of genetic variants using bar-coded multiplexed sequencing. Nat. Methods. 5 (10), 887-893 (2008).
- Wagle, N., Berger, M. F., Davis, M. J., et al. High-throughput detection of actionable genomic alterations in clinical tumor samples by targeted, massively parallel sequencing. Cancer Discov. 2 (1), 82-93 (2012).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Depristo, M. A., Banks, E., Poplin, R., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat. Genet. 43 (5), 491-498 (2011).
- Robinson, J. T., Thorvaldsdottir, H., Winckler, W., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Cibulskis, K., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
- Larson, D. E., Harris, C. C., Chen, K., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
- Saunders, C. T., Wong, W. S., Swamy, S., Becq, J., Murray, L. J., Cheetham, R. K. Strelka: Accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
- Albers, C. A., Lunter, G., Macarthur, D. G., Mcvean, G., Ouwehand, W. H., Din del Durbin, R. Accurate indel calls from short-read data. Genome Res. 21 (6), 961-973 (2011).
- Li, S., Li, R., Li, H., et al. Efficient identification of indels from short paired reads. Genome Res. 23 (1), 195-200 (2013).
- Sindi, S., Helman, E., Bashir, A., Raphael, B. J. A geometric approach for classification and comparison of structural variants. Bioinformatics. 25 (12), 222-230 (2009).
- Chen, K., Wallis, J. W., Mclellan, M. D., et al. BreakDancer: an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation. Nat. Methods. 6 (9), 677-681 (2009).
- Wang, J., Mullighan, C. G., Easton, J., et al. CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution. Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).
- Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability. Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study. Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).
- Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity. BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).
