Détecter des altérations génétiques somatiques dans des échantillons de tumeurs par Exon et le séquençage massivement parallèle

Résumé

Nous décrivons la préparation de banques d'ADN code-barres et ultérieure capture d'exon base hybridation pour la détection de mutations clés associés au cancer dans des échantillons de tumeurs cliniques par séquençage massivement parallèle "prochaine génération". Séquençage de l'exon ciblée offre les avantages d'un débit élevé, faible coût, et la couverture de séquence profond, donnant ainsi une grande sensibilité pour la détection de mutations de basse fréquence.

Résumé

Les efforts visant à détecter et enquêter sur des mutations oncogènes clés sont révélés précieux pour faciliter le traitement approprié pour les patients atteints de cancer. La mise en place de haut-débit, le séquençage massivement parallèle "nouvelle génération" a aidé la découverte de beaucoup de ces mutations. Pour améliorer l'utilité clinique et translationnelle de cette technologie, les plates-formes doivent être à haut débit, le coût-efficace, et compatible avec de la paraffine fixés au formol (FFPE) intégré échantillons de tissus qui peuvent donner de petites quantités d'ADN dégradé ou endommagé. Ici, nous décrivons la préparation de banques d'ADN code-barres et multiplexés suivie d'une hybridation de capture sur la base-des exons ciblés pour la détection de mutations associées au cancer dans les tumeurs congelées et FFPE fraîches par séquençage massivement parallèle. Cette méthode permet l'identification de mutations de la séquence, le nombre de copies des modifications, et sélectionner réarrangements structuraux impliquant tous les gènes ciblés. Séquençage de l'exon offres ciblées til bénéficie d'un débit élevé, faible coût, et la couverture de séquence profond, conférant ainsi une haute sensibilité pour détecter des mutations de basse fréquence.

Introduction

L'identification des événements génétiques tumorales «driver» dans oncogènes clés et des gènes suppresseurs de tumeurs joue un rôle essentiel dans le diagnostic et le traitement de nombreux cancers ^1. Efforts de recherche à grande échelle en utilisant le séquençage massivement parallèle "nouvelle génération" ont permis l'identification de plusieurs de ces gènes associés au cancer au cours des dernières années ^2. Cependant, ces plates-formes de séquençage nécessitent généralement de grandes quantités de l'ADN isolé à partir de tissus congelés frais, ce qui présente donc une limitation importante dans l'analyse et la caractérisatio....

Protocole

Une. Préparation des réactifs et de l'ADN

Remarque: Ce protocole décrit le traitement simultané et l'analyse des 24 échantillons (par exemple 12 paires tumeur / normal), mais peut être adaptée pour des lots plus petits et plus grands. échantillons d'ADN peuvent provenir de FFPE ou tissu frais congelé, les échantillons cytologiques, ou de sang. Typiquement, à la fois la tumeur et le tissu normal du même patient sont profilées conjointement de manière à distinguer les mutations somatiques de polymorphismes héritées. Le protocole commence immédiatement après l'extraction d'ADN.

1. Aliquote de 50 à 250 ng ....

Résultats

Une piscine de 24 banques de séquences à code-barres (12 paires de tumeurs à la normale) a été capturée à l'aide des sondes correspondant à tous les exons codant pour des protéines de 279 gènes du cancer et séquencé comme 2 x 75 pb lit sur une seule voie d'une cellule d'écoulement HiSeq 2000. Tumeur et les bibliothèques normales ont été rassemblées dans un rapport de 2:1. des mesures de performance de l'échantillon pour un mélange d'échantillons d'ADN de tumeur congelés sont présentés sur

Discussion

Notre essai IMPACT produit un taux élevé d'alignement, le taux sur la cible haut, couverture cible haute et haute sensibilité pour la détection des mutations, indels, et du nombre de copies des modifications. Nous avons démontré la capacité de notre essai IMPACT à l'ADN de séquence à la fois frais congelé et archivé échantillons FFPE de faible apport d'ADN. En effectuant le séquençage de l'exon ciblé de gènes associés au cancer principaux, on peut obtenir une couverture de séquence très profond pour les .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
NEBNext Module de réparation d’extrémité	New England Biolabs	E6050L	;
NEBNext dA-Tailing Module New	England Biolabs	E6053L	;
NEBNext Module de ligature rapide	New England Biolabs	E6056L	;
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter Genomics		;
Codes-barres NEXTflex PCR Free &ndash ; 24	Bioo Scientific	514103	;
Kit d’amplification de bibliothèque HiFi	KAPA Biosystems	KK2612	;
COT ADN humain, qualité fluorométrique	Roche Diagnostics	05 480 647 001	;
NimbleGen SeqCap EZ Kit d’hybridation et de lavage	Roche NimbleGen	05 634 261 001	;
SeqCap EZ Library Appâts	Roche NimbleGen		;
QIAquick Kit de Purification PCR	Qiagen	28104	;
Kit de dosage Qubit dsDNA Broad Range (BR)	Technologies	Q32850	;
Kit de dosage haute sensibilité (HS) Qubit dsDNA	Technologies	Q32851	;
Kit HS Agilent DNA	Agilent Technologies	5067-4626, 4627	;
Bioanalyseur Agilent 2100	Agilent Technologies		;
Covaris E220	Covaris		;
Support magnétique-96	Ambion	AM10027	;
Illumina Hi-Seq 2000	Illumina		;

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