Détection, visualisation et la quantification de la production d'espèces réactives de l'oxygène dans un système modèle Amoeba

Résumé

Nous avons adapté un ensemble de protocoles pour la mesure d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) qui peuvent être appliqués dans différents modèles cellulaires amibes et de mammifères pour les études qualitatives et quantitatives.

Résumé

Espèces réactives de l'oxygène (ROS) comprennent une gamme de molécules contenant de l'oxygène réactif et de courte durée, qui sont dynamiquement interconvertis ou éliminées soit catalytique ou spontanément. En raison de la durée de vie courte de la plupart des ROS et la diversité de leurs sources et localisations subcellulaires, une image complète peut être obtenue que par des mesures précises en utilisant une combinaison de protocoles. Ici, nous présentons un ensemble de trois protocoles différents à l'aide OxyBurst vert (OBG) revêtu perles, ou dihydroethidium (DHE) et Amplex Ultrared (AUR), de suivre qualitativement et quantitativement différents ROS dans les phagocytes professionnels tels que Dictyostelium. Nous avons optimisé les procédures de revêtement de perles et perles occasion OBG-enduits et microscopie en direct de visualiser dynamiquement intraphagosomal génération de ROS au niveau d'une seule cellule. Nous avons identifié le lipopolysaccharide (LPS) de E. coli comme un puissant stimulateur de la production de ROS dans Dictyostelium. En outre, nous Dtemps réel eveloped, essais à moyen débit utilisant DHE et AUR à mesurer quantitativement dismutase intracellulaire et H ₂ O ₂ de production extracellulaire, respectivement.

Introduction

Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont impliqués dans une grande variété de processus biologiques tels que la défense de l'hôte, la signalisation, le développement tissulaire et réponse à la lésion, ainsi que l'hypertension artérielle et du cancer. Le mécanisme de la NADPH oxydase phagosome bien étudié est dédié à la génération de ROS rapide, connu sous le burst oxydatif, pour tuer les bactéries ingérées dans les phagosomes de neutrophiles ^1. En outre, les fuites d'électrons comme un sous-produit de la chaîne respiratoire mitochondriale a déjà été pensé pour être responsable que d'une source non réglementée de ROS. Mais récemment....

Protocole

Une. Visualisation et de mesure qualitative de la production de ROS dans phagosomes

Les perles OBG enduits doivent être préparés à l'avance. Les procédures de revêtement de perles et technique de gélose sont adaptés de références publiées ^5,14.

1. Ajouter 1 ml de la suspension de 3,0 um billes de silice carboxylés (environ 1,8 x 10 ⁹ billes) dans un tube de 1,5 ml, laver les billes 3 fois avec 1 ml de PBS par centrifugation rapide et tourbillonnement.
2. Remettre en suspension les billes dans 1 ml de PBS contenant 25 mg / ml de cyanamide (pour activer les perles de silice se lient de manière covale....

Résultats

La génération de ROS dans les phagosomes peut être visualisé qualitativement et de façon dynamique par microscopie (S1 du fichier). La fluorescence rouge émise par Alexa Fluor 594 est insensible au pH et reste constante dans le milieu de phagosome, tandis que l'oxydation de OBG augmente sa fluorescence dans le canal vert. Les spectres d'émission de oxydé in vitro et non oxydés OBG perles revêtues sont comparées sur la figure 1B, montrant une augmentation significative d.......

Discussion

Par rapport aux procédés décrits précédemment, le dosage OBG visualise dynamiquement le processus de génération de ROS phagosome au niveau de la cellule unique, au lieu de mesurer un signal moyen ROS partir d'une population de cellules. Ces méthodes population moyennes ont tendance à occulter des informations critiques causés par phagocytose non synchrone. Nous avons adapté avec succès DHE et AUR essais de Dictyostelium et optimisé les protocoles. Plus important encore, nous avons précisé les types et local.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
REAGENTS
OxyBURST Vert H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
Billes de silice carboxylées	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C medium	ForMedium	HLC0102
LoFlo medium	ForMedium	LF1001
Bacto	agar BD	204010
Dihydroethidium	Sigma	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
Raifort peroxydase	Roche	10108090001
Diethyldithiocarbamate (DEDTC)	Sigma	D3506-100G
Catalase	Sigma	C9322-1G
Cyanamide	Sigma	187364-25G
Lipopolysaccharides	Sigma	L2630-25G
EQUIPMENT
ibidi &mu ;-Dish 35 mm, high	ibidi	81156	Fond en plastique optiquement transparent
Plat MatTek 35 mm	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	Fond en lamelle en verre
Scepter Compteur de cellules	Merck Millipore	PHCC00000
Blanc Plaque 96 puits	Nunc	236108
Centrifugeuse	SORVALL	Legend RT
Lecteur de microplaques	BioTek	Synergy Mx