Afsløring, visualisere og kvantificering af generation af reaktive ilt arter i en amøbe Model System

Summary

Vi tilpasset et sæt protokoller til måling af reaktive ilt arter (ROS), som kan anvendes i forskellige amøber og pattedyrs cellulære modeller for kvalitative og kvantitative undersøgelser.

Abstract

Reaktive ilt arter (ROS) omfatter en række af reaktive og kortlivede, oxygenholdige molekyler, som er dynamisk interkonverterede eller elimineres enten katalytisk eller spontant. På grund af de korte levetid af de fleste ROS og mangfoldigheden af ​​deres kilder og subcellulære lokaliseringer kan et komplet billede kun opnås ved omhyggelige målinger ved hjælp af en kombination af protokoller. Her præsenterer vi et sæt af tre forskellige protokoller hjælp OxyBurst Grøn (OBG)-coatede perler eller dihydroethidium (DHE) og Amplex UltraRed (AUR), kvalitativt og kvantitativt at overvåge forskellige ROS i professionelle fagocytter såsom Dictyostelium. Vi optimeret perler belægning procedurer og brugte OBG-belagte kugler og levende mikroskopi til dynamisk visualisere intraphagosomal ROS generation på enkelt celle niveau. Vi identificerede lipopolysaccharid (LPS) fra E. coli som en potent stimulator for ROS generation i Dictyostelium. Desuden har vi developed realtid, medium-throughput analyser anvender DHE og AUR til kvantitativ måling af intracellulær superoxid og ekstracellulær H ₂ O ₂ produktion, hhv.

Introduction

Reaktive oxygenarter (ROS) er involveret i en lang række biologiske processer, såsom værtsforsvar signalering, væv udvikling og respons på skade samt forhøjet blodtryk og cancer. Den velundersøgte phagosomal NADPH oxidase maskiner er dedikeret til hurtig ROS generation, der er kendt som den oxidative burst, til at dræbe bakterier indtages i neutrofiler 'phagosomes ^1. Desuden blev lækage af elektroner som et biprodukt af mitokondrie respiratoriske kæde tidligere troede at kun ansvarlig for en ureguleret kilde af ROS. Men for nylig blev det identificeret som en vigtig mekanisme til at bidrage til intraphagosomal drab af bakterier i musemakrofager ^2. I de senere år har den sociale amøbe, Dictyostelium, bliver en magtfuld og populær model til at studere celle iboende mekanismer i medfødt immunrespons. Faktisk Dictyostelium og menneskelige fagocytter deler et overraskende højt niveau af beskyttelse i molecular machineries ansvarlige for bakterier sensing, engulfment og dræbte ^3,4. De homologer af proteiner og enzymer i forbindelse med produktionen af ROS eller afgiftning såsom NADPH oxidaser, katalaser, superoxid dismutases, kan findes i både human-og Dictyostelium. Som bedst undersøgte amøber Dictyostelium præsenterer flere unikke fordele i forhold til pattedyr-modelsystem. De vokser ved stuetemperatur uden behov for CO _2, med en fordoblingstid på 8-10 timer. De kan nemt holdes som adhærente eller suspensionskulturer. Hertil kommer, takket være deres fuldt sekventeret og kommenteret haploidgenom, samt til nem genetisk manipulation har Dictyostelium blive et meget attraktivt eksperimentel model organisme.

I tidligere undersøgelser, forskellige chlorerede og fluorerede derivater af fluorescein (kollektivt kendt som OxyBurst Green, OGB) der udsender fluorescens efter oxidation af ROS, er blevet anvendt som en ROS reporter. Celle-permeant esterified derivater bruges til at måle cytoplasmatisk ROS, mens celle-impermeabel dextran-eller protein-koblede derivater bruges til at måle ekstracellulære ROS. Navnlig har OGB BSA-belagte kugler allerede blevet anvendt til at påvise phagosomal produktionen af ROS i pattedyrceller ^5. Imidlertid kan mikropladelæseren tilgang kun give et gennemsnit ROS-generering kurven fra en population af celler. Med den nuværende protokol, ved hjælp af Dictyostelium, en professionel phagocyt og optimerede eksperimentelle betingelser, vi får en stabil og effektiv fagocytose uden conjugating nogen opsonin på perlerne. DHE har været anvendt i forskellige modelsystemer, såsom pattedyr neutrofiler og makrofager, for at påvise produktionen af ROS ^6-9. I mellemtiden er der nogle kontroverser over specificitet og sensitivitet af metoden ^8,10. Som en forbedret version af Amplex Red, fluorescensintensitet AUR er mindre følsomme over for pH-værdi, hvilket gør det mere egnet til at måleROS i ikke-neutrale eller svagt sure miljøer. AUR er for nylig blevet anvendt i flere pattedyrsystemer ^11,12, men er ikke blevet rapporteret endnu dens anvendelse i nonmammalian modeller, som ofte kræver svagt surt vækstmedier,. Desuden er der ingen offentliggjorte protokol til kvantitativt og dynamisk måle ROS produktion og lokalisering i den sociale amøbe Dictyostelium.

Målet med den præsenterede sæt af protokoller er at give en nem og alsidig løsning til at overvåge forskellige ROS og deres lokalisering, og yderligere giver indsigt i ROS-relaterede cellulære mekanismer. For OBG analysen, brugte vi levende mikroskopi til at overvåge hele processen med phagosomal ROS generation efter optagelse af OBG-belagte kugler fra Dictyostelium celler og tilvejebragt en ny tilgang til at studere den mekanisme af intraphagosomal drab af bakterier. Vi har optimeret medium-throughput DHE og AUR assays i Dictyostelium at måle intracellulær Superoxide og ekstracellulære H ₂ O _{2-produktion,} henholdsvis ved hjælp af LPS som en potent ROS stimulator. Bemærk, at LPS blev for nylig vist at forøge den baktericide aktivitet af Dictyostelium fremad fagocyteres bakterier ^13. Desuden behandling med DEDTC og katalase udtrykkeligt bekræftet, at disse to metoder, der specifikt måler forskellige typer og subcellulære lokaliseringer af realkreditobligationer i Dictyostelium. Endelig kan OGB assay tilpasset vedhængende fagocytisk celle, ved yderligere opsoniserende perlerne med ligander for fagocytiske receptorer af dyreceller. I princippet kan DHE og AUR assays også finjusteres til målinger i vedhængende eller nonadhærente celle under passende eksperimentelle betingelser.

Protocol

1.. Visualisering og Kvalitativ måling af ROS Produktion i Phagosomes De OBG-belagte kugler bør være forberedt på forhånd. De perler overtrækningsprocedurer og agaroverlejring teknik er tilpasset fra offentliggjorte referencer 5,14. Tilsæt 1 ml suspension af 3,0 mM carboxylerede silicaperler (ca. 1,8 x 10 9 perler) i et 1,5 ml rør, vaske perlerne 3x med 1 ml PBS ved hurtig spin og vortex. Resuspendere perlerne i 1 ml PBS indeholdende 25 mg /…

Representative Results

Den generation af ROS i phagosomes kan visualiseres kvalitativt og dynamisk ved mikroskopi (File S1). Den røde fluorescens, der udsendes af Alexa Fluor 594 er pH-ufølsom og forbliver konstant i phagosomal miljø, mens oxidation af OBG øger sin fluorescens i den grønne kanal. Emissionsspektret af in vitro-oxideret og nonoxidized OGB-belagte kugler er sammenlignet i figur 1B, der viser en betydelig stigning i intensitet efter oxidation. For at lette visualisering af live-begi…

Discussion

Sammenlignet med de tidligere beskrevne fremgangsmåder, OGB assayet dynamisk visualiserer processen phagosomal ROS-generering på enkelt celle niveau, i stedet for at måle en gennemsnitlig ROS signal fra en population af celler. Sådanne befolkning-gennemsnitsperioder metoder tendens til at tilsløre vigtige oplysninger forårsaget af asynkrone fagocytose. Vi har med held tilpasset DHE og AUR assays til Dictyostelium og optimeret protokollerne. Vigtigst er det, vi specificerede typer og subcellulære lokalise…

Materials

			REAGENTS
OxyBURST Green H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
Carboxylated silica beads	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C medium	ForMedium	HLC0102
LoFlo medium	ForMedium	LF1001
Bacto agar	BD	204010
Dihydroethidium	Sigma	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
Horseradish peroxidase	Roche	10108090001
Diethyldithiocarbamate (DEDTC)	Sigma	D3506-100G
Catalase	Sigma	C9322-1G
Cyanamide	Sigma	187364-25G
Lipopolysaccharides	Sigma	L2630-25G
			EQUIPMENT
ibidi μ-Dish 35 mm, high	ibidi	81156	Bottom made of optically clear plastic
MatTek dish 35 mm	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	Bottom made of a glass coverslip
Scepter Cell Counter	Merck Millipore	PHCC00000
White 96 well plate	Nunc	236108
Centrifuge	SORVALL	Legend RT
Microplate reader	BioTek	Synergy Mx