المضاعفة نيون ميكروأري لتحليل البروتين اللعابية الإنسان عن طريق البوليمر المجهرية وحزم الألياف البصرية
Summary
نحن تصف إجراءات التنميط البروتينات اللعابية باستخدام صفائف المضاعفة الأجسام المضادة المستندة إلى المكروية. كانت مرتبطة تساهميا الاجسام المضادة لفلوري ترميز الصبغة 4.5 ميكرومتر المجهرية البوليمر باستخدام الكيمياء carbodiimide. أودعت المجهرية المعدلة في microwells الألياف الضوئية لقياس مستويات بروتين في اللعاب باستخدام المناعية شطيرة مضان.
Abstract
هنا، نحن تصف بروتوكول للقياس في وقت واحد ستة البروتينات في اللعاب باستخدام الأجسام المضادة المكروية القائمة على مجموعة من الألياف البصرية. التكنولوجيا المناعية مجموعة العاملين يجمع بين مزايا القائمة على المكروية تعليق مجموعة تلفيق باستخدام المجهر مضان. كما هو موضح في بروتوكول الفيديو، وترميز المتاحة تجاريا المجهرية 4.5 ميكرومتر البوليمر في سبعة أنواع مختلفة، متباينة من قبل اثنين من تركيز الأصباغ الفلورية المحاصرين جسديا داخل المجهرية. تم تعديل المجهرية المشفرة التي تحتوي على مجموعات الكربوكسيل السطح مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة من خلال التقاط EDC / NHS اقتران الكيمياء. لتجميع ميكروأري البروتين، وأنواع مختلفة من المجهرية المشفرة وبين functionalized مختلطة عشوائيا وأودعت في 4.5 ميكرون microwells، والتي كانت محفورا كيميائيا في نهاية القريبة من حزمة من الألياف البصرية. تم استخدام حزمة من الألياف البصرية على حد سواء الناقل وللتصوير مicrospheres. مرة واحدة تجميعها، فقد تم استخدام ميكروأري لالتقاط البروتينات في طاف اللعاب التي تم جمعها من العيادة. واستند الكشف على المناعية شطيرة باستخدام مزيج من الأجسام المضادة الكشف عن البيروكسيديز التحاليل المختلفة مع لجنة التحقيق الفلورسنت streptavidin مترافق، R-فيكوإيريترين. تم تصوير ميكروأري بواسطة المجهر مضان في ثلاث قنوات مختلفة، واثنين للتسجيل المكروية واحد للإشارة الفحص. كانت الميكروسكوب مضان ثم فك الشفرة وتحليلها باستخدام خوارزمية محلية الصنع في MATLAB.
Introduction
منذ أول ميكروأري ذكرت من قبل كافة Schena وزملاء العمل في منتصف 1990s، وقد استخدمت هذه الأداة القوية في العديد من مجالات البحوث البيولوجية 1. ميكروأرس الضد قادرة على اكتشاف البروتينات في وقت واحد في عدة سوائل التشخيص، مثل الدم، ولها تطبيقات مهمة في التشخيص السريري وفحص العلامات البيولوجية 2-10. اللعاب، يحتوي على العديد من نفس التحاليل والدم، فقد اعتبر كبديل أفضل من الدم لجمع اللعاب آمنة، موسع، ويمكن القيام بها من قبل العاملين الطبيين المدربين الحد الأدنى من 11-13. حاليا، وتحليل البروتين المضاعفة باستخدام عينات من اللعاب محدودة بسبب عدة عوامل هامة، بما في ذلك تركيز منخفض من الهدف الحليلة 14 ومجموعة واسعة من المؤشرات الحيوية تركيز مختلفة 15.
.هنا، ونحن لشرح تحليل ستة البروتينات: عامل النمو البطاني الوعائي الإنسان (VEGF)، انترفيرون غاما الناجمة عن البروتين 10 (IP-10)، انترلوكين 8 (IL-8)، وعامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي)، المصفوفة metallopeptidase 9 (MMP-9)، وانترلوكين 1 بيتا (IL-1β) . تم التحقق من أداء الأسلوب في البداية باستخدام الحلول القياسية تشكل البروتينات المؤتلف تحليلها وعرقلة العازلة. تم اختبار عينات اللعاب التي تم جمعها من المرضى الحقيقية لمختلف الأمراض التنفسية المزمنة وكذلك الاصحاء أيضا مع أداء مرضيا. وينبغي أن يكون البروتوكول تنطبق على التحاليل البروتين الأخرى وغيرها من المقايسات القائم المكروية. هذه المنصة توفر مزايا كبيرة لمجال الكيمياء التحليلية، لأنها تتيح سريعة ودقيقة، وقابلة للتكرار التحليل المتزامن لتركيزات منخفضة من البروتينات عدة مع مجموعة واسعة ديناميكية، والحد الأدنى التفاعلات غير محددة، وانخفاض استهلاك العينة، والتكلفة المنخفضة بالمقارنة إلى مماثلة انزيم مرتبط المناعي-مقايسة (ELISA).
Protocol
Representative Results
Discussion
يجب على الباحثين إيلاء اهتمام إضافي إلى الخطوات التالية: للحصول على أفضل دقة فك التشفير، فمن الضروري للتحقق من والمجهرية علقت متجانس في جميع الحضانة وغسل الخطوات أثناء إجراء ترميز المجهرية. بالإضافة إلى ذلك، تحتاج المجهرية المشفرة أن تكون محمية من الضوء في كافة مرا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (منحة 08UDE017788-05). كما يقر EBP بدعم من مؤسسة الإسبانية للعلوم والتكنولوجيا (FECYT). المؤلفين أشكر شوندا T. جايلورد وPratyusha Mogalisetti لقراءة نقدية للمخطوطة.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
References
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. . Protein Microarray. , (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
- Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
- de Jager, W., Velthuis, t. e., Prakken, H., Kuis, B. J., W, G. T., Rijkers, Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
- Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
- Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
- Mukhopadhyay, R. Devices to drool for. Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).
- Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
- Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
- St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
- Pantano, P., Walt, D. R. Ordered nanowell arrays. Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).
- Schena, M. . Protein Microarrays. , (2005).
