معطفا البذور الفراش الفحص لاستكشاف وراثيا<em> في المختبر</em> كيف إنبات البذور في الضوابط السويداء<em> نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em
Summary
نقدم الإجراء لتجميع البذور الفراش معطف مقايسة (SCBA) من بذور نبات الأرابيدوبسيس thaliana. وقد أظهرت SCBA أن تكون أداة قوية لاستكشاف وراثيا في المختبر وكيفية إنبات البذور الضوابط السويداء في البذور نائمة واستجابة لمنبهات الضوء. وSCBA هو من حيث المبدأ المعمول بها تحت أي الحالة التي يشتبه السويداء على التأثير في النمو الجنيني.
Abstract
يتكون السويداء نبات الأرابيدوبسيس من طبقة وحيدة الخلية المحيطة الجنين ناضجة ويلعب دورا أساسيا لمنع إنبات البذور نائمة أو أن البذور nondormant المشع من قبل الحمراء بعيدة (FR) نبض الضوء. من أجل مزيد من التبصر في الآليات الوراثية الجزيئية الكامنة وراء النشاط القمعية الإنبات بواسطة السويداء المبذولة، وقد وضعت "البذور الفراش معطف" مقايسة (SCBA). وSCBA هو إجراء تشريح فصل جسديا معاطف البذور والأجنة من البذور، والتي تسمح بمراقبة نمو الأجنة على طبقة الأساسية من المعاطف البذور. بشكل ملحوظ، وSCBA reconstitutes الأنشطة القمعية إنبات البذور معطف في سياق سكون البذور والسيطرة FR-تعتمد على إنبات البذور. منذ SCBA يسمح باستخدام اندماجي من سبات، وnondormant المعدلة وراثيا معطف البذور والمواد الجنينية، مسارات الجينية السيطرة على الإنبات وتحديدا المرجعيمكن تشريح بتوليد في السويداء والجنين. نحن هنا التفاصيل الإجراء لتجميع SCBA.
Introduction
في نبات الأرابيدوبسيس البذور الناضجة، ويتكون غلاف البذرة من تيستا، وهي الطبقة الخارجية من النسيج الميت من أصل الأمهات، والسويداء، وطبقة وحيدة الخلية من الأنسجة الحية التي تحيط مباشرة الجنين 1. وتستمد السويداء والجنين من الأحداث الإخصاب منفصلين: السويداء هو نسيج ثلاثي الصيغة الصبغية مع اثنين من الأم والأب واحد الجينوم في حين أن الجنين هو نسيج مضاعفا مع الأمهات واحدة واحدة الجينوم الأب 2.
وتتمثل المهمة الرئيسية المسندة تقليديا إلى السويداء هو أن الأنسجة الغذائية. ومع ذلك، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن السويداء أيضا يلعب دورا مركزيا للسيطرة على إنبات البذور. أصبحت هذه الفكرة على ما يبدو لأول مرة في حالة السكون، وهي سمة التي أظهرتها البذور المنتجة حديثا. تفشل البذور لتنبت في سبات عميق رغم وجود ظروف إنبات مواتية. البذور تفقد السكون بهم بعد فترة النضوج وأصبحت nondormanر، أي أنها سوف تنبت عندما تتعرض لظروف إنبات مواتية. في كثير من الأنواع النباتية، بما في ذلك النباتات نبات الأرابيدوبسيس النموذج، يلزم معطف البذور على الاطلاق لمنع إنبات البذور نائمة منذ إزالة غلاف البذرة يؤدي النمو الجنيني وتخضير 3،4. في نبات الأرابيدوبسيس، بثك وآخرون. احظت أن الإنبات ظلت مكبوتة بعد إزالة تيستا مع الحفاظ على السويداء المحيطة السويداء 5. وأشارت هذه الملاحظات بشدة أن السويداء هو الأنسجة داخل غلاف البذرة تمارس النشاط القمعية على الجنين. ومع ذلك، وبذور التجارب إزالة معطف لا تساعد بالضرورة توضيح طبيعة النشاط القمعية التي تقدمها إنبات البذور معطف ولا تحديد الجينات التي تنفيذه.
قدمنا مؤخرا فحص البذور الفراش معطف (SCBA) حيث يتم فصل المعاطف البذور والأجنة جسديا لكنها أبقت في الدنو وثيقميتي بحيث يتم الحفاظ على النشاط القمعية الإنبات التي تقدمها السويداء 6. وSCBA يسمح باستخدام اندماجي من سبات، nondormant، والبذور المعدلة وراثيا معطف والمواد الجنينية. ونتيجة لذلك، فإن مسارات الوراثية السيطرة على الإنبات وتعمل تحديدا في السويداء والجنين يمكن تشريح. تم استخدام SCBA في سياق السكون لإظهار أن السويداء تطلق حمض الأبسيسيك هرمون نباتي (ABA) نحو الجنين لقمع نموها 6. وعلاوة على ذلك يمكن أن نستخدمها في SCBA لتحديد مسارات الإشارات التي تعمل في السويداء والأنسجة الجنينية لتعزيز السكون.
وتم تعزيز دور السويداء للسيطرة على إنبات المزيد من خلال النظر في حالة البذور nondormant تتعرض لنبض أحمر بكثير (FR) الخفيفة. في وقت مبكر عند تشرب البذور يعرف نبضة الضوء FR لمنع إنبات 7،8. عندما أزيلت المعاطف البذور من بذور نبضة الضوء FRلم يستطع أن يمنع إنبات، يشير بقوة إلى أن السويداء ويمكن أيضا قمع إنبات البذور nondormant 9. بشكل ملحوظ، ويمكن أيضا أن تستخدم SCBA أن ألخص التي تعتمد على تثبيط إنبات FR. يسمح هذا لإظهار أن ذلك يعتمد-FR تثبيط إنبات البذور هو أيضا عملية تنطوي على الإفراج ABA من السويداء 9. وعلاوة على ذلك، سمحت SCBA تحديد مسارات مختلفة ضوء يشير الحكومية العاملة في السويداء والجنين للسيطرة على إنبات البذور nondormant استجابة لمنبهات ضوء 9،10.
وبالتالي فإن SCBA يبدو أن تقنية موثوقة لاستكشاف وظيفة السويداء في سياق السيطرة على إنبات البذور. بل هو أيضا أداة قوية لتقييم ما إذا كانت الجينات في المختبر يشتبه في السيطرة على إنبات تعمل في السويداء، والجنين أو كليهما الأنسجة. نحن هنا بالتفصيل الخطوات المختلفة اللازمة لتجميع SCBA.
Protocol
Representative Results
Discussion
البذور الفراش معطف مقايسة (SCBA) الإجراء الموضح هنا هو من حيث المبدأ ينطبق على أي ظرف من الظروف حيث يتم حظر إنبات البذور نبات الأرابيدوبسيس (أو تأخر) والتي يشتبه السويداء لتنفيذ هذا الاعتقال. هذا الأخير يمكن أن يتضح من إزالة غلاف البذرة (تيستا والسويداء) وملاحظا أن ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية ودولة جنيف.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | To refer |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
References
- Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis. Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).
- Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants. Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).
- Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -. M., Bradford, K., Nonogaki, H. . Seed development, dormancy and germination. , 25-43 (2007).
- Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. Seed dormancy and the control of germination. New Phytol. 171, 501-523 (2006).
- Bethke, P. C., et al. The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy. Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).
- Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).
- Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development. Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).
- Shinomura, T., et al. Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).
- Lee, K. P., et al. Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B. Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).
- Lee, K. P., Lopez-Molina, L. Control of seed germination in the shade. Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity. EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).
- Debeaujon, I., Koornneef, M. Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid. Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).
- Sun, T. P., Kamiya, Y. The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis. Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).
- Alonso, J. M., et al. Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science. 301, 653-657 (2003).
- Rook, F., et al. Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling. Plant J. 26, 421-433 (2001).
