Un cappotto Seed Bedding Assay per esplorare geneticamente<em> In Vitro</em> Come la Germinazione Controlli endosperma del seme in<em> Arabidopsis thaliana</em
Summary
Vi presentiamo la procedura per assemblare un seme saggio di biancheria da letto di mano (SCBA) da Arabidopsis thaliana semi. La SCBA ha dimostrato di essere uno strumento potente per esplorare geneticamente e in vitro come il germinazione del seme controlli endosperma nei semi dormienti e in risposta a stimoli luminosi. L'autorespiratore in linea di principio applicabile in qualsiasi situazione in cui l'endosperma è sospettato di influenzare la crescita embrionale.
Abstract
L'endosperma Arabidopsis è costituito da un singolo strato di cellule che circonda l'embrione maturo e gioca un ruolo essenziale per impedire la germinazione dei semi dormienti o di semi nondormant irradiati da un impulso di luce rosso lontano (FR). Al fine di ottenere ulteriori informazioni sui meccanismi genetici molecolari alla base della germinazione attività repressiva esercitata dal endosperma, un saggio di "assestamento cappotto di seme" (SCBA) è stato concepito. La SCBA è una procedura di dissezione separando fisicamente tegumenti ed embrioni da semi, che consente il monitoraggio della crescita di embrioni in uno strato sottostante di cappotti di seme. Sorprendentemente, l'autorespiratore ricostituisce la germinazione attività repressive del cappotto di seme nel contesto della dormienza dei semi e di controllo FR-dipendente di germinazione dei semi. Poiché l'autorespiratore consente l'utilizzo combinatoria di dormienti, nondormant e geneticamente modificati tegumento e materiali embrionali, i percorsi genetici che controllano la germinazione e specificatamente opdendo per l'endosperma ed embrione può essere sezionato. Qui ci dettaglio la procedura per assemblare un autorespiratore.
Introduction
In Arabidopsis semi maturi, il cappotto di seme è composto dalla testa, uno strato esterno di tessuto morto di origine materna, e l'endosperma, un singolo strato di cellule di tessuto vivo che circonda direttamente l'embrione 1. L'endosperma e l'embrione sono derivati da eventi fecondazione distinti: il endosperma è un tessuto triploide con due materna e un genoma paterno che l'embrione è un tessuto diploide con una materna e un genoma paterno 2.
La funzione principale tradizionalmente assegnato al endosperma è quello di un tessuto nutritivo. Tuttavia, è sempre più evidente che l'endosperma svolge un ruolo centrale per controllare la germinazione dei semi. Questa nozione è diventato il primo evidente nel caso di dormienza, un tratto esibita da semi di nuova produzione. Semi dormienti non riescono a germinare nonostante la presenza di condizioni di germinazione favorevoli. I semi perdono la loro dormienza dopo un periodo di maturazione e diventano nondormant, cioè germineranno quando esposto a condizioni favorevoli di germinazione. In molte specie vegetali, tra cui la pianta modello Arabidopsis, il cappotto di seme è assolutamente necessaria per impedire la germinazione dei semi dormienti poiché la rimozione tegumento innesca la crescita embrionale e greening 3,4. In Arabidopsis, Bethke et al. Ha osservato che la germinazione è rimasta repressa dopo aver tolto la testa, pur mantenendo l'endosperma che circonda l'endosperma 5. Queste osservazioni hanno indicato con forza che l'endosperma è il tessuto all'interno del cappotto di seme esercitando un'attività repressiva sull'embrione. Tuttavia, seme esperimenti rimozione coat non necessariamente aiutano chiarire la natura della germinazione attività repressiva fornite dal tegumento né identificare i geni che implementano.
Abbiamo recentemente introdotto un test di biancheria cappotto di seme (SCBA) dove cappotti di seme ed embrioni sono separati fisicamente, ma tenuti in prossimmità modo che l'attività repressiva germinazione fornita dal endosperma viene mantenuta 6. L'autorespiratore consente l'uso combinatorio di dormienti, nondormant e geneticamente modificati tegumento e materiali embrionali. Come risultato, i percorsi genetici che controllano la germinazione e specificamente operante nel endosperma ed embrione può essere sezionato. La SCBA stato usato nel contesto della dormienza per dimostrare che l'endosperma rilascia l'acido abscissico phytohormone (ABA) verso l'embrione di reprimere la sua crescita 6. Inoltre, potremmo usare l'autorespiratore per identificare le vie di segnalazione che operano in endosperma e tessuti embrionali per promuovere la dormienza.
Il ruolo del endosperma di controllare la germinazione è stata ulteriormente rafforzata considerando il caso delle sementi nondormant esposti a un impulso di rosso lontano (FR) della luce. Presto su imbibizione semi di un impulso luminoso FR è noto per inibire la germinazione 7,8. Quando tegumenti sono stati rimossi dai semi un impulso di luce FRera in grado di inibire la germinazione, suggerendo fortemente che l'endosperma può anche reprimere la germinazione dei semi nondormant 9. Sorprendentemente, la SCBA potrebbe anche essere utilizzato per ricapitolare inibizione FR-dipendente di germinazione. Questo ha permesso di dimostrare che tale FR-dipendente inibizione della germinazione dei semi è anche un processo che coinvolge ABA liberazione dal endosperma 9. Inoltre, l'autorespiratore permesso identificare le differenti vie di segnalazione luminosa che operano nel endosperma e l'embrione di controllare la germinazione dei semi nondormant in risposta a stimoli luminosi 9,10.
La SCBA sembra quindi essere una tecnica affidabile per esplorare la funzione del endosperma nell'ambito del controllo di germinazione dei semi. E 'anche un potente strumento per valutare in vitro se i geni sospettati di controllare germinazione operare nel endosperma, l'embrione o entrambi i tessuti. Qui abbiamo dettaglio le varie fasi necessarie per assemblare un autorespiratore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Procedura Il test biancheria cappotto di seme (SCBA) qui descritto è in linea di principio applicabile a qualsiasi circostanza in cui la germinazione del seme di Arabidopsis è bloccato (o ritardato) e dove l'endosperma è sospettato di implementare questo arresto. Quest'ultimo può essere provata togliendo il cappotto di seme (testa e endosperma) e osservando che i proventi di crescita embrionali più veloce rispetto a quella osservata quando gli embrioni sono circondati dal tegumento. La germinazione…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Science Foundation svizzero e dallo Stato di Ginevra.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | To refer |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
References
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