Vi presenterer fremgangsmåten for å sette sammen en frøhylsteret sengetøy analysen (SCBA) fra Arabidopsis thaliana frø. Den SCBA ble vist seg å være et kraftig verktøy for å utforske genetisk og in vitro hvordan stivelse kontroller frø spiring i sovende frø og i respons til lys signaler. Den SCBA er i prinsippet som gjelder under noen situasjon der det er analysert er mistenkt for å påvirke embryonale vekst.
Den Arabidopsis endosperm består av et enkelt cellelag som omgir det modne embryo og spille en viktig rolle for å forhindre spiring av frø i hvilende tilstand eller som av nondormant frø bestrålt av en langt rød (FR) lyspuls. For ytterligere å få innsikt i de molekylære genetiske mekanismene bak spiring undertrykkende aktivitet utøves av stivelse, ble en "seed coat bedding" analysen (SCBA) utviklet. Den SCBA er en disseksjon prosedyre fysisk skille frø strøk og embryoer fra frø, som tillater overvåking veksten av embryo på et underliggende lag av frø strøk. Bemerkelsesverdig, rekonstruerer SCBA spiring undertrykkende aktiviteter av frø pels i sammenheng med frø dvalen og FR avhengig styring av frø spiring. Siden SCBA tillater kombi bruk av sovende, nondormant og genmodifiserte frø pels og embryonale materialer, de genetiske trasé kontrollerende spiring og spesielt opMed drifts i endosperm og embryo kan bli dissekert. Her har vi detalj prosedyren for å sette sammen en SCBA.
I Arabidopsis modne frø, blir frø pels bestående av testa, et ytre lag av dødt vev av maternal opprinnelse, og endosperm, en enkelt celle laget av levende vev direkte omgir embryoet 1. Stivelse og embryoet er utledet fra separate befruktning hendelser: stivelse er en triploid vev med to mødre og en faderlig genomet mens fosteret er en diploid vev med en mors og en fars genom to.
Hovedfunksjonen som tradisjonelt er tilordnet stivelse er at av en næringsverdi vev. Imidlertid er det stadig tydeligere at stivelse spiller også en sentral rolle for å kontrollere frø spiring. Denne forestillingen ble først synlig i tilfellet uvirksom, en egenskap som utvises av nylig produserte frø. Dormant frø unnlater å spire til tross for tilstedeværelsen av gunstige spirebetingelser. Frø mister dvalen etter en modningsperioden og bli nondormant, dvs. de vil spire når de utsettes for gunstige spireforhold. I mange plantearter, inkludert modell anlegg Arabidopsis, er frøet pelsen helt nødvendig for å hindre spiring av sovende frø siden frøhylsteret fjerning utløser embryonale vekst og Greening 3,4. I Arabidopsis, Bethke et al. Observert at spiring forble trykt etter å ha fjernet testa samtidig opprettholde stivelse rundt endosperm fem. Disse observasjoner indikerte at stivelse er vevet i frøhylsteret utøve en undertrykkende aktivitet på embryoet. Men ikke seedet frakk fjerning eksperimenter ikke nødvendigvis hjelpe å avklare innholdet av spiring undertrykkende aktivitet gitt av frøet pelsen heller identifisere genene som implementerer den.
Vi har nylig introdusert et frø frakk sengetøy analysen (SCBA) hvor frø strøk og embryoer er fysisk atskilt, men holdt i nært Proxistemmelse slik at spiring undertrykkende aktivitet gitt av stivelse er opprettholdt seks. Den SCBA tillater kombi bruk av sovende, nondormant, og genmodifiserte frø pels og embryonale materialer. Som et resultat, kan de genetiske trasé kontrollerende spiring og spesielt opererer i endosperm og embryoet blir dissekert. Den SCBA ble brukt i sammenheng med dvalen for å vise at stivelse utgivelser phytohormone abscisic syre (ABA) mot fosteret å undertrykke sin vekst seks. Videre kunne vi bruke røykdykker å identifisere signalveier som opererer i endosperm og embryonale vev for å fremme dvalen.
Rollen av stivelse for å kontrollere spiring ble ytterligere styrket ved å vurdere saken på nondormant frø utsatt for en puls på langt rødt (FR) lys. Tidlig på frø imbibition en FR lys puls er kjent for å hemme spiring 7,8. Når sette strøk ble fjernet fra frøene en puls av FR lysetvar ute av stand til å hemme spiring, sterkt tyder på at stivelse kan også undertrykke spiring av nondormant frø ni. Bemerkelsesverdig, kan det overtrykk også brukes til å rekapitulere FR-avhengig inhibering av spiring. Denne lov til å vise at at FR avhengig hemming av frø spiring er også en prosess som involverer ABA utgivelse fra stivelse ni. Videre røykdykker tillot identifisering av de forskjellige lys-signalveier som opererer i endosperm og embryoet for å styre nondormant frøspiring som reaksjon på lys signaler 9,10.
Den med overtrykk ser derfor ut til å være en pålitelig teknikk for å utforske funksjon av stivelse i forbindelse med kontroll av frøspiring. Det er også et kraftig verktøy for å bedømme in vitro vidt gener som mistenkes for å styre spiring operere i endosperm, embryo eller begge vevene. Her har vi detalj de ulike trinnene som kreves for å sette sammen en SCBA.
Frøet strøk sengetøy analysen (SCBA) prosedyre som er beskrevet her er i prinsippet som gjelder til enhver omstendighet hvor Arabidopsis frø spiring er blokkert (eller forsinket) og hvor stivelse er mistenkt for å implementere denne arrestasjonen. Sistnevnte kan være dokumentert ved å fjerne frø pels (testa og stivelse) og observere at embryonale veksten fortsetter raskere i forhold til det som er observert når embryoer er omgitt av frøet pelsen. Spiring kan blokkeres i respons på bestemte miljø fys…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den sveitsiske National Science Foundation og av staten av Genève.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | To refer |
Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |