Un Abrigo Ropa de cama de Ensayo de Semillas para explorar Genéticamente<em> In Vitro</em> ¿Cómo la germinación de semillas en Controles Endosperma<em> Arabidopsis thaliana</em
Summary
Se presenta el procedimiento para montar un ensayo de la ropa de cama cubierta de la semilla (SCBA) a partir de semillas de Arabidopsis thaliana. El SCBA ha demostrado ser una herramienta poderosa para explorar genéticamente in vitro y la forma en la germinación de los controles del endospermo de semillas de semillas latentes y en respuesta a las señales de luz. El SCBA es, en principio, aplicable en virtud de cualquier situación en la que se sospecha que el endospermo de influir en el crecimiento embrionario.
Abstract
El endospermo de Arabidopsis consta de una sola capa de células que rodea el embrión maduro y que juega un papel esencial para prevenir la germinación de semillas latentes o que de semillas nondormant irradiados por un pulso de luz roja lejana (FR). Con el fin de obtener una mayor comprensión de los mecanismos genéticos moleculares que subyacen a la actividad represiva de germinación ejercida por el endospermo, se ideó un ensayo de "ropa de cama cubierta de la semilla" (SCBA). El SCBA es un procedimiento de disección separar físicamente las cubiertas seminales y embriones de las semillas, que permite monitorizar el crecimiento de los embriones sobre una capa subyacente de cubiertas de las semillas. Sorprendentemente, el ERA reconstituye las actividades de represión de germinación de la cubierta de la semilla en el contexto de la latencia de las semillas y el control FR-dependiente de la germinación de la semilla. Desde la SCBA permite el uso combinatorio de cubierta de la semilla latente, nondormant y modificada genéticamente y los materiales embrionarias, las vías genéticas que controlan la germinación y específicamente operating en el endospermo y el embrión puede ser diseccionado. Aquí detallamos el procedimiento para ensamblar un SCBA.
Introduction
En semillas maduras de Arabidopsis, la cubierta de la semilla se compone de la testa, una capa externa de tejido muerto de origen materno, y el endospermo, una sola capa de células de tejido vivo que rodea directamente el embrión 1. El endospermo y el embrión se derivan de acontecimientos de fertilización separados: el endospermo es un tejido triploide con dos materna y uno genoma paterno mientras que el embrión es un tejido diploide con uno materna y uno genoma paterno 2.
La función principal tradicionalmente asignado al endospermo es la de un tejido nutritivo. Sin embargo, cada vez es más evidente que el endospermo también juega un papel central para el control de la germinación de semillas. Esta idea se convirtió en la primera patente en el caso de inactividad, un rasgo exhibido por semillas de nueva producción. Las semillas en dormancia no germinan a pesar de la presencia de condiciones de germinación favorables. Las semillas pierden su letargo después de un período de maduración y se convierten en nondormant, es decir que van a germinar cuando se expone a condiciones de germinación favorables. En muchas especies de plantas, incluyendo la planta modelo Arabidopsis, la cubierta de la semilla es absolutamente necesaria para evitar la germinación de las semillas latentes desde la extracción cubierta de la semilla desencadena el crecimiento embrionario y la ecologización de 3,4. En Arabidopsis, Bethke et al. Observó que la germinación se mantuvo reprimida después de la eliminación de la testa, manteniendo el endospermo que rodea el endospermo 5. Estas observaciones indican fuertemente que el endospermo es el tejido dentro de la cubierta de la semilla ejerciendo una actividad represiva en el embrión. Sin embargo, los experimentos de remoción de semillas capa no necesariamente ayudan a aclarar la naturaleza de la actividad represiva de germinación proporcionada por la cubierta de la semilla, ni la identificación de los genes que lo implementan.
Recientemente hemos introducido un ensayo de la ropa de cama cubierta de la semilla (SCBA) en caso de cubiertas de las semillas y embriones están físicamente separados pero mantienen en estrecha proximidad de modo que la actividad represiva de germinación proporcionado por el endospermo se mantiene 6. El SCBA permite el uso combinatorio de cubierta de la semilla latente, nondormant y modificada genéticamente y los materiales embrionarias. Como resultado, las vías genéticas que controlan la germinación y operar específicamente en el endospermo y el embrión pueden ser diseccionados. El SCBA se utiliza en el contexto de la latencia para mostrar que el endospermo libera la fitohormona ácido abscísico (ABA) hacia el embrión a reprimir su crecimiento 6. Además podemos usar el SCBA para identificar las vías de señalización que actúan en el endospermo y tejidos embrionarios para promover la latencia.
El papel del endospermo para controlar la germinación se fortaleció aún más al considerar el caso de las semillas nondormant expuestas a un pulso de rojo lejano (FR) de luz. Temprano en imbibición de la semilla se conoce un pulso de luz FR para inhibir la germinación de 7,8. Cuando cubiertas de las semillas se extrajeron a partir de semillas de un pulso de luz FRfue incapaz de inhibir la germinación, lo que sugiere fuertemente que el endosperma también puede reprimir la germinación de semillas nondormant 9. Sorprendentemente, el ERA también se podría utilizar para recapitular la inhibición FR-dependiente de la germinación. Esto permitió demostrar que la inhibición que FR-dependiente de la germinación de la semilla es también un proceso que implica la liberación de ABA del endospermo 9. Además, el SCBA permitió identificar las diferentes vías de señalización luminosa que funciona en el endospermo y el embrión para controlar la germinación de semillas nondormant en respuesta a señales de luz de 9,10.
Por consiguiente, el SCBA parece ser una técnica fiable para explorar la función del endospermo en el contexto del control de la germinación de la semilla. También es una herramienta poderosa para evaluar in vitro si los genes sospechosos para controlar la germinación operan en el endospermo, el embrión o ambos tejidos. A continuación te detallamos los distintos pasos necesarios para montar un SCBA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Procedimiento El ensayo de cama cubierta de la semilla (SCBA) descrito aquí es en principio aplicable a cualquier circunstancia en la que se bloquea la germinación de semillas de Arabidopsis (o atrasados) y donde el endospermo se sospecha de implementar este arresto. Este último puede ser evidenciado por la eliminación de la cubierta de la semilla (testa y el endospermo) y observando que avanza el crecimiento de embriones más rápidas respecto a la observada cuando los embriones están rodeadas por la cubi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza y por el Estado de Ginebra.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | To refer |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
References
- Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis. Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).
- Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants. Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).
- Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -. M., Bradford, K., Nonogaki, H. . Seed development, dormancy and germination. , 25-43 (2007).
- Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. Seed dormancy and the control of germination. New Phytol. 171, 501-523 (2006).
- Bethke, P. C., et al. The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy. Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).
- Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).
- Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development. Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).
- Shinomura, T., et al. Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).
- Lee, K. P., et al. Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B. Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).
- Lee, K. P., Lopez-Molina, L. Control of seed germination in the shade. Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity. EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).
- Debeaujon, I., Koornneef, M. Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid. Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).
- Sun, T. P., Kamiya, Y. The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis. Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).
- Alonso, J. M., et al. Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science. 301, 653-657 (2003).
- Rook, F., et al. Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling. Plant J. 26, 421-433 (2001).
