En Seed Coat Bedding analys till Genetiskt Upptäck<em> In Vitro</em> Hur frövitan Controls frögroning i<em> Arabidopsis thaliana</em
Summary
Vi presenterar proceduren att montera ett fröskal sängar analys (SCBA) från Arabidopsis thaliana frön. Den SCBA visade sig vara ett kraftfullt verktyg för att utforska genetiskt och in vitro hur frövitan kontroller frögroning i vilande frön och som ett svar på ljussignaler. Den SCBA är i princip tillämplig enligt alla situationer där det finns misstanke om frövitan att påverka foster-tillväxt.
Abstract
Den Arabidopsis frövita består av ett enda cellager som omger den mogna embryo och spelar en viktig roll för att förhindra groning av vilande frön eller det av nondormant frön bestrålats med ett långt rött (FR) ljuspuls. För att ytterligare få insikt i de molekylära genetiska mekanismer som ligger bakom den grobarhet repressiv verksamhet som utövas av frövita, var en "fröskal strö"-analys (SCBA) utarbetat. SCBA är en dissektion förfarande fysiskt separera fröhöljen och embryon från frön, som tillåter att övervaka tillväxten av embryon på ett underliggande skikt av fröhöljen. Anmärkningsvärt, den SCBA rekonstituerar groningen repressiva verksamhet fröhöljet i samband med frö dvala och FR-beroende kontroll av utsäde grobarhet. Eftersom SCBA tillåter kombi användning av vilande, nondormant och genetiskt modifierade fröskal och embryonala material, de genetiska vägar som kontrollerar groning och specifikt oprande i frövita och embryo kan dissekeras. Här vi detalj proceduren att montera en SCBA.
Introduction
I Arabidopsis mogna frön, är fröskalet består av testa, ett yttre lager av död vävnad från moderdjuret, och frövitan, en enda cell lager av levande vävnad som direkt omger embryot 1. Frövita och embryo kommer från olika gödslingshändelser: frövitan är en triploid vävnad med två mödrar och en faderlig genomet medan embryot är en diploid vävnad med en maternal och en faderlig genomet 2.
Den huvudsakliga funktionen traditionellt tilldelats endospermen är det av en närande vävnad. Dock har det blivit alltmer uppenbart att frövitan spelar också en central roll för att styra frögroning. Detta begrepp blev först uppenbart i fallet med dvala, en egenskap som uppvisas av nyproducerade frön. Vilande frön inte gror trots förekomsten av gynnsamma grobarhet förhållanden. Källor förlorar sin dvala efter en mognadsperiod och blir nondormant, det vill säga de kommer att gro när de utsätts för gynnsamma grobarhet förhållanden. I många växtarter, bland annat modellväxten Arabidopsis, är fröskalet absolut krävs för att förhindra groning av vilande frön eftersom fröskalet borttagning utlöser embryonal tillväxt och grönare 3,4. I Arabidopsis, Bethke et al. Konstaterade att grobarheten varit undertryckt efter att ta bort testa samtidigt som frövita omger frövitan 5. Dessa observationer indikerade starkt att endospermen är den vävnad inom fröskalet utöva en hämmande aktivitet på embryot. Däremot behöver fröskal borttagning experiment inte nödvändigtvis bidra till att klargöra vilken typ av groning undertryckande aktivitet tillhandahållits av fröskalet eller identifiera de gener som implementerar det.
Vi introducerade nyligen ett fröskal sängar analys (SCBA) där fröhöljen och embryon är fysiskt åtskilda men hålls i nära proxistämmelse så att groningen repressiv verksamhet som tillhandahålls av frövitan bibehålls 6. SCBA tillåter kombinato användning av vilande, nondormant, och genetiskt modifierade fröskal och embryonala material. Som ett resultat kan de genetiska vägar som kontrollerar groning och specifikt verksamma i frövitan och embryot dissekerades. SCBA användes i samband med dvala att visa att endospermen frisätter fytohormonerna abskisinsyra (ABA) till embryot för att undertrycka tillväxten 6. Vi kan dessutom använda SCBA att identifiera de signalvägar som är verksamma i frövitan och embryonala vävnader för att främja dvala.
Rollen av frövitan styra groning stärktes ytterligare genom att betrakta det gäller nondormant frön utsätts för en puls med långt rött (FR) ljus. Tidigt på frö uppsugning en FR ljuspuls är kända för att hämma groning 7,8. När fröhöljen togs bort från frön en puls av FR ljuskunde inte hämma groning, starkt tyder på att frövitan även kan undertrycka groning av nondormant fröer 9. Anmärkningsvärt nog kan SCBA också användas för att rekapitulera FR beroende hämning av groning. Detta tillåtet att visa att det FR beroende hämning av frögroning är också en process med ABA frigivning från frövitan 9. Dessutom SCBA tillåtet att identifiera de olika ljus-signalvägar som är verksamma i frövitan och embryot att styra nondormant frögroning som svar på ljussignaler 9,10.
SCBA synes därför vara en tillförlitlig teknik för att undersöka funktionen av endospermen i samband med kontroll av frögroning. Det är också ett kraftfullt verktyg för att bedöma in vitro huruvida gener som misstänks för att kontrollera grobarheten arbeta i frövitan, embryot eller båda vävnader. Här är vi i detalj de olika steg som krävs för att sätta ihop en SCBA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fröskalet sängar analys (SCBA) procedur som beskrivs här är i princip varje omständighet där Arabidopsis frögroning är blockerad (eller fördröjd) och när det finns misstanke frövitan att genomföra denna gripande. Det senare kan bevisas genom att ta bort fröskalet (testa och frövitan) och observera att embryonala tillväxtskrider snabbare i förhållande till vad som ses när embryona är omgivna av fröskalet. Groning kan blockeras som reaktion på särskilda miljö fysiska parametrar (t.ex.<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag från den schweiziska National Science Foundation och av staten i Genève.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | To refer |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
References
- Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis. Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).
- Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants. Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).
- Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -. M., Bradford, K., Nonogaki, H. . Seed development, dormancy and germination. , 25-43 (2007).
- Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. Seed dormancy and the control of germination. New Phytol. 171, 501-523 (2006).
- Bethke, P. C., et al. The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy. Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).
- Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).
- Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development. Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).
- Shinomura, T., et al. Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).
- Lee, K. P., et al. Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B. Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).
- Lee, K. P., Lopez-Molina, L. Control of seed germination in the shade. Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity. EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).
- Debeaujon, I., Koornneef, M. Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid. Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).
- Sun, T. P., Kamiya, Y. The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis. Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).
- Alonso, J. M., et al. Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science. 301, 653-657 (2003).
- Rook, F., et al. Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling. Plant J. 26, 421-433 (2001).
