En frøskaller Bedding Assay til Genetisk Udforsk<em> In Vitro</em> Hvordan endosperm Controls frøspiring i<em> Arabidopsis thaliana</em
Summary
Vi præsenterer den procedure, for at samle en frøskal sengetøj assay (SCBA) fra Arabidopsis thaliana frø. Den SCBA viste sig at være et effektivt redskab til at udforske genetisk og in vitro hvordan endosperm kontrol frøspiring i hvilende frø og som reaktion på lys signaler. Den SCBA er i princippet gælder i henhold til enhver situation, hvor endosperm er mistænkt for at påvirke embryonale vækst.
Abstract
Arabidopsis frøhvide består af et enkelt cellelag omkring modne foster og spiller en afgørende rolle for at forhindre spiring af hvilende frø eller af nondormant frø bestrålet med et langt rødt (FR) lyspuls. For yderligere at få indsigt i de molekylære genetiske mekanismer bag spiring undertrykkende aktivitet udøves af endosperm, blev en "frøskal strøelse" assay (SCBA) udtænkt. Den SCBA er en dissektion procedure fysisk adskillelse frøskaller og embryoner fra frø, som tillader overvågning væksten af fostre på et underliggende lag af frøskaller. Bemærkelsesværdigt, at SCBA genopretter spiringen undertrykkende aktiviteter frøskallen i forbindelse med frø vækstdvale og FR-afhængig styring af frøspiring. Siden SCBA tillader kombinatoriske brug af hvilende, nondormant og genetisk modificerede frø pels og embryonale materialer, de genetiske mekanismer, der styrer spiring og specifikt opprimær i endosperm og embryo kan dissekeres. Her har vi detaljeret gennemgang af proceduren for at samle en SCBA.
Introduction
I Arabidopsis modne frø er frøskallen består af frøskal, et ydre lag af dødt væv af maternel oprindelse og endosperm et enkelt cellelag af levende væv, der omslutter embryo 1. Endosperm og embryoet stammer fra separate befrugtning begivenheder: endosperm er en triploid væv med to mødre og en faderlig genom mens fosteret er en diploid væv med en maternel og en faderlig genom 2.
Den vigtigste funktion traditionelt tildelt endosperm, er en nærende væv. Imidlertid er det i stigende grad klart, at endosperm også spiller en central rolle for at kontrollere frøspiring. Dette begreb blev først synlige i tilfælde af hvileperioden, et træk, som udvises af nyligt fremstillede frø. Hvilende frø ikke spire på trods af tilstedeværelsen af gunstige spiringsbetingelser. Frø mister deres hviletilstand efter en modningsperiode og blive nondormant, dvs de vil spire når de udsættes for gunstige spiringsbetingelser. I mange plantearter, herunder den model plante Arabidopsis er frøskal absolut påkrævet for at forhindre spiring af hvilende frø siden frøskal fjernelse udløser embryonale vækst og grønnere 3,4. I Arabidopsis, Bethke et al. Observeret, at spiring forblev undertrykt efter fjernelse af testa samtidig bevare endosperm omgiver endosperm 5.. Disse observationer stærkt indiceret, endosperm er væv i frøskallen udøver en undertrykkende aktivitet på embryoet. Men frøskal fjernelse eksperimenter ikke nødvendigvis bidrage til at tydeliggøre arten af spiring undertrykkende aktivitet, som frøskallen heller ikke identificere de gener, der gennemfører det.
Vi har for nylig indført en frøskal sengetøj assay (SCBA) hvor frøskaller og embryoner er fysisk adskilte, men holdt i tæt Proximelse, således at spiring undertrykkende aktivitet, som endosperm opretholdes 6. Den SCBA tillader det kombinatoriske anvendelse af hvilende, nondormant, og genetisk modificerede frøskal og embryonale materialer. Som et resultat heraf kan de genetiske mekanismer, der styrer spiring og specifikt opererer i endospermen og embryo dissekeres. Den SCBA blev brugt i forbindelse med vækstdvale at vise, at endosperm frigiver phytohormone abscisinsyre (ABA) mod foster til at undertrykke sin 6. vækst. Desuden kunne vi bruge SCBA at identificere de signalveje, der opererer i frøhvide og embryonale væv for at fremme vækstdvale.
Den rolle, endosperm at kontrollere spiring blev yderligere styrket ved at overveje tilfælde af nondormant frø udsat for en puls af langt rødt (FR) lys. Tidligt på frø imbibition en FR lyspuls er kendt for at hæmme spiring 7,8. Når frøskaller blev fjernet fra frø en puls af FR lysvar ude af stand til at hæmme spiring, kraftigt tyder på, at frøhvide også kan undertrykke spiring af nondormant frø 9. Bemærkelsesværdigt kunne SCBA også anvendes til at rekapitulere FR-afhængig inhibering af spiring. Dette lov til at vise, at der FR-afhængig hæmning af frøspiring er også en proces, der involverer ABA frigivelse fra endosperm 9. Desuden SCBA tilladt at identificere de forskellige lys-signalveje, der opererer i endosperm og embryoet til at styre nondormant frøspiring reaktion på lys tidskoder 9,10.
Den SCBA synes derfor at være en pålidelig teknik til at undersøge funktionen af endosperm i forbindelse med kontrollen af frøspiring. Det er også et effektivt redskab til at vurdere, in vitro, om gener, der mistænkes for at styre spiring opererer i endosperm, fosteret eller begge væv. Her har vi detaljeret de forskellige trin, der kræves for at samle en SCBA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Frøskallen sengetøj assay (SCBA) her beskrevne procedure er i princippet anvendelse på enhver omstændighed, hvor Arabidopsis spiring er blokeret (eller forsinket), og hvor endosperm er mistænkt for at gennemføre denne anholdelse. Sidstnævnte kan dokumenteres ved at fjerne frøskallen (Testa og endosperm) og observere, at embryonale vækst provenu hurtigere i forhold til der ses, når fostre er omgivet af frøskallen. Spiring kan være blokeret som reaktion på særlige miljømæssige fysiske parametre <e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den schweiziske National Science Foundation og staten i Genève.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | To refer |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
References
- Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis. Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).
- Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants. Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).
- Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -. M., Bradford, K., Nonogaki, H. . Seed development, dormancy and germination. , 25-43 (2007).
- Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. Seed dormancy and the control of germination. New Phytol. 171, 501-523 (2006).
- Bethke, P. C., et al. The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy. Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).
- Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).
- Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development. Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).
- Shinomura, T., et al. Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).
- Lee, K. P., et al. Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B. Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).
- Lee, K. P., Lopez-Molina, L. Control of seed germination in the shade. Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity. EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).
- Debeaujon, I., Koornneef, M. Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid. Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).
- Sun, T. P., Kamiya, Y. The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis. Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).
- Alonso, J. M., et al. Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science. 301, 653-657 (2003).
- Rook, F., et al. Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling. Plant J. 26, 421-433 (2001).
