Generalist के पेट में metabolically सक्रिय बैक्टीरिया की पहचान<em> स्पोडोप्टेरा littoralis</em> डीएनए स्थिर आइसोटोप के माध्यम का उपयोग की जांच<sup> 13</sup> सी ग्लूकोज
Summary
स्पोडोप्टेरा littoralis के पेट के साथ जुड़े सक्रिय जीवाणु समुदाय, pyrosequencing के लिए युग्मित स्थिर आइसोटोप जांच (एसआईपी) द्वारा निर्धारित किया गया था. इस पद्धति का उपयोग करना, समुदाय के भीतर metabolically सक्रिय बैक्टीरिया की प्रजातियों की पहचान उच्च संकल्प और परिशुद्धता के साथ किया गया था.
Abstract
सबसे कीड़ों की हिम्मत सहजीवी nonpathogenic बैक्टीरिया की जटिल समुदायों द्वारा बसे हुए हैं. ऐसे माइक्रोबियल समुदायों के भीतर यह खानेवाला या पारस्परिक बैक्टीरिया की प्रजातियों की पहचान करने के लिए संभव है. बाद वाले, यानी दूसरों के बीच में, आवश्यक अमीनो एसिड 4 के संश्लेषण सहित, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 2, फेरोमोन उत्पादन 3, साथ ही पोषण बढ़ाने, कीट प्रजनन 1 में मदद करने, कीट को कई कार्यों की सेवा करने के लिए मनाया गया है.
कारण इन संगठनों के महत्व को, कई प्रयासों के व्यक्तिगत सदस्यों के लिए नीचे समुदायों को चिह्नित किया गया है. हालांकि, इन प्रयासों से अधिकांश या तो खेती के तरीकों के आधार पर या अंतिम पहचान के लिए अनुक्रम थे जो -16 rRNA जीन टुकड़े की पीढ़ी पर भरोसा किया गया. दुर्भाग्य से, इन तरीकों केवल आंत में मौजूद बैक्टीरियल प्रजातियों की पहचान की है और कोई informat प्रदान कीसूक्ष्मजीवों की चयापचय क्रिया पर आयन.
एक कीट के पेट में metabolically सक्रिय बैक्टीरियल प्रजातियों को चिह्नित करने के लिए, हम एक सार्वभौमिक सब्सट्रेट के रूप में 13 सी ग्लूकोज रोजगार विवो में (एसआईपी) की जांच कर स्थिर आइसोटोप इस्तेमाल किया. यह उनके विशेष चयापचय गतिविधि को माइक्रोबियल phylogenies का लिंकेज की अनुमति देता है कि एक होनहार संस्कृति से मुक्त तकनीक है. इस तरह के डीएनए और आरएनए के रूप में 5 माइक्रोबियल बायोमार्कर, में substrates से स्थिर, आइसोटोप लेबल परमाणुओं पर नज़र रखने के द्वारा ही संभव है. डीएनए unlabeled (12 सी) एक की तुलना में लेबल डीएनए का घनत्व बढ़ जाती है में 13 सी के समावेश आइसोटोप. अंत में, 13 सी लेबल डीएनए या शाही सेना 12 सी unlabeled इसी तरह एक 6 से घनत्व ढाल ultracentrifugation द्वारा अलग किया जाता है. अलग हो न्यूक्लिक एसिड isotopomers के बाद आणविक विश्लेषण प्रजातियों की चयापचय गतिविधि और पहचान के बीच कनेक्शन प्रदान करता है.
यहाँ, हम एक generalist कीट (हमारे मॉडल प्रणाली), स्पोडोप्टेरा littoralis (लेपिडोप्टेरा, Noctuidae) के पेट में metabolically सक्रिय बैक्टीरिया विशेषताएँ इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल उपस्थित थे. डीएनए की वंशावली विश्लेषण कीट आंत जीवाणु समुदाय की पहचान में उच्च संकल्प और सटीक अनुमति दी है जो pyrosequencing, उपयोग किया गया था. मुख्य सब्सट्रेट के रूप में, 13 सी लेबल ग्लूकोज प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया था. सब्सट्रेट एक कृत्रिम आहार का उपयोग कीड़ों को खिलाया गया था.
Introduction
कीट बैक्टीरियल सहजीवी संघों कीट प्रजातियों 7 की एक बड़ी संख्या के लिए जाना जाता है. इन सहजीवी संघों में सूक्ष्मजीवों कीड़ों की वृद्धि और विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. रोगाणुओं होस्ट करने के लिए कीट आवश्यक अमीनो एसिड 4 के संश्लेषण सहित प्रजनन 1, फेरोमोन जैवसंश्लेषण 3, पोषण, और दुर्गम भोजन के पाचन के लिए योगदान करने के लिए दिखाया गया है. पेट बैक्टीरियल संघों की विशाल विविधता के बावजूद बहुत कम वे कीट के पक्ष में खेलने के कार्यात्मक भूमिका के बारे में जाना जाता है. केवल दीमक के मामले में, lignocellulose की सहजीवी पाचन प्रोकीर्योट्स, प्रोटोजोआ, और कवक द्वारा किए गए व्यापक रूप से 8,9 अध्ययन किया गया है. इस के विपरीत, थोड़ा generalist कीड़ों का पेट कपास leafworm IE में उपस्थित सहजीवी संघ के बारे में जाना जाता है, स्पोडोप्टेरा सामान्य होने के कारण संयंत्र सेनाओं के उनके लगातार बदलाव करने के लिए, इसके अलावा. LittoralisIST कीटों और उनके पेट जुड़े बैक्टीरियल समुदायों स्थायी रूप से अपने भोजन की आदतों फाइटोकेमिकल्स की अधिकता के साथ पौधों लेने से जुड़ा हुआ नई चुनौतियों को उजागर कर रहे हैं. इस के अलावा, lepidopterans में पेट पर्यावरण, दर असल क्योंकि उच्च पेट पीएच 10 के जीवाणुओं के विकास के लिए एक कठोर वातावरण का प्रतिनिधित्व करता है. विशेष रूप से एस के मामले में littoralis, यह पर्वतमाला अग्रांत्र में 10.5 से, आद्यमध्यांत्र में सीए. 9 लगभग 7 पश्चांत्र 11 में पीएच के लिए. दूसरी ओर, जीवाणु समुदाय एस के पेट के साथ जुड़े littoralis सरल है. तांग, Freitak, एट अल. 12 इस कीट के साथ जुड़े जीवाणु समुदाय के केवल सदस्यों के रूप में 7 अलग अलग प्रजातियों के जीवाणु की कुल से संबंधित 36 phylotypes की एक अधिकतम की सूचना दी. इस के अलावा, कोई जटिल पालन प्रक्रिया प्रयोगशाला में कीट विकास के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, यह और कीट का संक्षिप्त जीवन चक्र बहु - जी की सुविधाenerational पढ़ाई, पेट सूक्ष्म जीव बातचीत के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली में इस प्रजाति बदल रहे हैं.
पीसीआर आधारित अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के आगमन के साथ, कई जीवों (यानी मनुष्य, कीड़े, या समुद्री जीवों) के पेट बायोटा के साथ काम कर पढ़ाई की संख्या बढ़ गई है. इसके अलावा, परिणाम अतीत में के रूप में अलगाव और पेट harbored बैक्टीरिया की खेती से सम्बंधित नहीं हैं. बैक्टीरिया का लगभग 99% कृषि योग्य नहीं हैं और पेट में प्रचलित पर्यावरण की स्थिति का अनुकरण 12 मुश्किल है. पीसीआर का उपयोग करके, -16 rRNA जीन टुकड़े (बैक्टीरिया के बीच एक व्यापक रूप से इस्तेमाल वंशावली जीन मार्कर) चुनिंदा अनुक्रम आंत जीवाणु समुदायों की एक मिश्रित डीएनए टेम्पलेट से परिलक्षित, और क्लोन किया जा सकता है. इस जानकारी के साथ, उपयोगकर्ता सार्वजनिक डेटाबेस 13,14 से अनुक्रम जानकारी पुन: प्राप्त करने के बाद बैक्टीरियल प्रजातियों की पहचान करने में सक्षम है. फिर भी, अनुक्रमण जीवाणु का वर्णन करने के लिए दृष्टिकोणसमुदायों के कारण समुदाय के भीतर व्यक्तिगत प्रजातियों के आंतरिक चयापचय योगदान के बारे में जानकारी की कमी के कारण अपर्याप्त रहते हैं.
स्थिर आइसोटोप (एसआईपी) की जांच एक होनहार संस्कृति से मुक्त तकनीक है. यह अक्सर विशेष चयापचय गतिविधियों से जुड़ा हुआ माइक्रोबियल phylogenies का विश्लेषण करने के लिए पर्यावरण सूक्ष्म जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता है. इस तरह के फॉस्फोलिपिड व्युत्पन्न फैटी एसिड, डीएनए, और शाही सेना के रूप में 5 माइक्रोबियल बायोमार्कर, में substrates से स्थिर, आइसोटोप लेबल परमाणुओं नज़र रखने के द्वारा हासिल की है. न्यूक्लिक एसिड पर विचार कर, कार्यप्रणाली घनत्व ढाल ultracentrifugation 6 से unlabeled डीएनए से 13 सी लेबल या डीएनए की जुदाई पर आधारित है. कारण डीएनए लेबल और चयापचय गतिविधि के बीच यह सीधा संबंध के लिए, न्यूक्लिक एसिड की एक बहाव आणविक विश्लेषण प्रजातियों की पहचान करता है और चयापचय गतिविधियों के बारे में जानकारी प्रदान करता है. इसके अलावा, डीएनए पीएं और pyrosequencing के संयोजन से लागू के रूप मेंPilloni, वॉन Netzer, एट अल. 15, भारी 13 सी लेबल डीएनए अंश में मौजूद बैक्टीरियल प्रजातियों की एक विशेष सरल और संवेदनशील पहचान परमिट. अब तक, इस तकनीक एरोबिक 16,17 और अवायवीय स्थितियों 18,19 के तहत मिट्टी में biogeochemical प्रक्रियाओं में शामिल बैक्टीरियल समुदायों का वर्णन करने के लिए लागू किया गया है. एक nondigestible कार्बोहाइड्रेट के जवाब में मानव आंतों microbiota के विभिन्न वंशावली समूहों की चयापचय गतिविधियों का वर्णन किया जो REICHARDT, एट अल. 5, द्वारा रिपोर्ट के रूप में पर्यावरण विज्ञान के क्षेत्र में उपयोग के अलावा, तकनीक चिकित्सा विज्ञान में लागू किया गया है.
यहाँ हम आंत में पाचन सक्रिय प्रजातियों के जीवाणु के डीएनए 'लेबल' के लिए 13 सी ग्लूकोज का उपयोग करें. ग्लूकोज अपवादों 20 से जाना जाता है, बड़े पैमाने पर Entner-Doudoroff (ईडी) मार्ग के साथ सबसे बैक्टीरियल प्रजातियों द्वारा उपयोग एक चीनी है. यहब्याज की मेटाबोलाइट्स और स्थापित रास्ते साथ कार्बन स्रोत के बीच एक लिंक प्रदान करता है कि एक विश्वसनीय चयापचय जांच के रूप में 13 सी ग्लूकोज के उपयोग को सही ठहराते हैं. वैज्ञानिक सवाल है, अन्य substrates, यानी 13 सी मीथेन, 13 सीओ 2, या एक 13 सीओ 2 माहौल के तहत उठाए गए पौधों पर निर्भर करता है, चयापचय गतिविधियों का पता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस बिंदु पर, हम एक generalist कीट, अर्थात् एस के पेट जीवाणु समुदाय की उपापचयी लक्षण वर्णन में लागू किया प्रोटोकॉल पेश littoralis (लेपिडोप्टेरा, Noctuidae). इसके अलावा, तकनीक बदले में उच्च संकल्प और परिशुद्धता के साथ कीट आंत जीवाणु समुदाय की पहचान की अनुमति देता है जो pyrosequencing, करने के लिए मिलकर किया गया था. मुख्य सब्सट्रेट के रूप में, 13 सी लेबल ग्लूकोज प्रयोगों के दौरान उपयोग किया गया था.
Protocol
Representative Results
Discussion
सबसे कीड़ों का पेट एक अमीर और जटिल माइक्रोबियल समुदाय बंदरगाहों, आम तौर पर 10 7 -10 9 प्रोकार्योटिक कोशिकाओं ज्यादातर मामलों में मेजबान की अपनी कोशिकाओं outnumbering, वहाँ दर्ज. इस प्रकार, कीट पेट पारस्परि?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रयोगशाला सहायता के लिए एंजलिका बर्ग धन्यवाद. इस काम के मैक्स प्लैंक सोसायटी और माइक्रोबियल कम्युनिकेशन (JSMC) के लिए जेना स्कूल द्वारा समर्थित और वित्त पोषण किया गया.
Materials
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
References
- Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).
- Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore. Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone. J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).
- Douglas, A. E. Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera. Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).
- Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota. Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing – linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
- Gil, R., Latorre, A., Moya, A. Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics. Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).
- Brune, A., VH, R. e. s. h., Cardé, R. T. . Encyclopedia of Insects. , 1132 (2005).
- Breznak, J. A., Brune, A. Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites. Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).
- Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods. Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).
- Funke, M., et al. Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae. Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).
- Tang, X. S., et al. Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae. PloS One. 7, (2012).
- Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).
- Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. Microbial ecology and evolution – a ribosomal-rna approach. Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).
- Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP. FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).
- Lu, Y. H., Conrad, R. In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere. Science. 309, 1088-1090 (2005).
- Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature. 403, 646-649 (2000).
- Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species. J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).
- Dunford, E. A., Neufeld, J. D. DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP). J. Vis. Exp. (42), (2010).
- Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation. Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).
- Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients. Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).
- Ishak, H. D., et al. Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing. Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).
- Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment. Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).
- Dillon, R. J., Dillon, V. M. The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions. Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).
- Neufeld, J. D., et al. DNA stable-isotope probing. Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing – linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
