Identifiering av metaboliskt aktiva bakterier i tarmen hos Generalist<em> Spodoptera littoralis</em> Via DNA stabil isotop Probing Använda¹³ C-Glukos

Summary

Den aktiva bakteriesamhället i samband med tarmen av Spodoptera littoralis, bestämdes med stabil-isotop-sondering (SIP) kopplad till pyrosekvensering. Med användning av denna metod, var identifieringen av de metaboliskt aktiva bakteriespecies i samhället gjort med hög upplösning och precision.

Abstract

Guts flesta insekter är bebodda av komplexa samhällen av symbiotiska icke-patogena bakterier. Inom sådana mikrobiella samhällen är det möjligt att identifiera kommen eller mutualistic bakteriearter. De senare, har observerats att tjäna flera funktioner till insekten, det vill säga att hjälpa i insekts reproduktion ^1, öka immunsvaret ^2, feromonproduktion ^3, samt näring, däribland syntesen av essentiella aminosyror ^4, bland annat.

På grund av betydelsen av dessa föreningar, har många ansträngningar gjorts för att karakterisera de samhällen ned till de enskilda medlemmarna. Men de flesta av dessa ansträngningar var antingen baserade på odlingsmetoder eller förlitat sig på generering av 16S rRNA genen fragment som sekvenserades för slutlig identifiering. Tyvärr är dessa metoder bara identifierat de bakteriearter som finns i tarmen och under förutsättning att ingen informatjonen på den metaboliska aktiviteten hos mikroorganismerna.

För att karakterisera de metaboliskt aktiva bakteriearter i tarmen hos en insekt, använde vi stabil isotop sondering (SIP) in vivo med användning av ¹³ C-glukos som en universell substrat. Detta är ett lovande kultur fria teknik som tillåter bindningen av mikrobiella fylogenier till deras speciella metaboliska aktiviteten. Detta är möjligt genom att spåra stabila isotopmärkta atomer från substrat i mikrobiella biomarkörer, såsom DNA-och ^RNA-5. Införlivandet av ¹³ C-isotoperna i DNA ökar densiteten av det märkta DNA: t i förhållande till den omärkta ⁽¹² C) ett. I slutändan är den ¹³ C-märkt DNA eller RNA separerades genom densitetsultracentrifugering från ¹² C-omärkt liknande en ^6. Efterföljande molekylär analys av de separerade nukleinsyrasekvenser isotopomererna tillhandahåller anslutningen mellan metabolisk aktivitet och identiteten av arten.

Här presenterar vi det protokoll som används för att karakterisera de metaboliskt aktiva bakterier i tarmen hos en generalist insekt (vårt modellsystem), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Den fylogenetisk analys av DNA utfördes med användning av pyrosekvensering, som tillät hög upplösning och precision vid identifiering av insekts gut bacterial community. Som huvudsakliga substrat, var ¹³ C-märkt glukos användes i experimenten. Substratet matades till de insekter med hjälp av en konstgjord diet.

Introduction

Insect-bakteriella symbiotiska föreningar är kända för ett stort antal insektsarter ^7. I dessa symbiotiska föreningar, mikroorganismer spelar en viktig roll i tillväxten och utvecklingen av insekter. Mikrober har visat sig bidra till en insekt reproduktion ^1, feromon biosyntes ^3, näring, inklusive syntes av essentiella aminosyrorna ⁴ och digerering av otillgängliga mat till värden. Trots det stora utbudet av gut-bakteriella föreningar, än mindre är känt om den funktionella roll de spelar till förmån för insekten. Endast i fall av termiter, det symbiotiska digestion av lignocellulosa utförs av prokaryoter, protozoer och svampar, har studerats ingående ^8,9. I motsats till detta, är lite känt om det symbiotiska förening som finns i tarmen av generalist insekter dvs bomulls leafworm, littoralis Spodoptera. Dessutom på grund av sin täta förskjutning av växtvärdar, allmänist insekter och deras gut associerade bakteriesamhällen är ständigt utsatta för nya utmaningar kopplade till deras matvanor krävande anläggningar med en uppsjö av fytokemikalier. Bredvid detta tarmen miljö lepidopterans representerar i sig en hård miljö för tillväxt av bakterier på grund av den höga gut pH ^10. Särskilt i fallet med S. littoralis, varierar den från 10,5 i framtarmen, ca. 9 i midgut att pH-värdet nästan 7 i hindgut ^11. Å andra sidan, den bakteriella gemenskap associerad med tarmen hos S. littoralis är enkel. Tang, Freitak, et al. ¹² rapporterade högst 36 phylotypes tillhör totalt 7 olika bakteriearter som de enda medlemmarna av bakteriesamhället i samband med denna insekt. Förutom detta, är ingen komplicerad uppfödning förfarande krävs för insekters tillväxt i laboratoriet. Dessutom är det här, och den korta livscykel insekt lätta multi-generational studier, svarvning denna art i ett perfekt modellsystem för att studera gut-mikrob-interaktioner.

Med tillkomsten av PCR-baserade sekvensering teknik, har flera studier som behandlar gut biota av flera organismer (dvs. människor, insekter, eller marina organismer) ökat. Dessutom är resultaten oberoende av isolering och odling av tarm hyste bakterier som tidigare. Nästan 99% av bakterier är inte förökas och simulering av de miljöförhållanden som råder i tarmen är svår ^12. Genom att använda PCR, kunde 16S rRNA genfragment (en allmänt använd fylogenetisk gen markör bland bakterier) selektivt amplifieras från en blandad DNA-mall av tarmbakteriesamhällen, sekvenseras och klonas. Med denna information kan användaren identifiera bakteriearter efter hämtning av sekvensinformation från offentliga databaser ^13,14. Ändå närmar sig sekvensering för att beskriva bakteriellsamhällen förblir otillräckliga på grund av bristande information om den inneboende metaboliska bidrag av enskilda arter inom gemenskapen.

Stabil-isotop sondering (SIP) är ett lovande kultur-fri teknik. Den används ofta i miljömikrobiologi för att analysera mikrobiella fylogenier kopplade till speciella metaboliska aktiviteter. Detta uppnås genom att spåra stabila isotopmärkta atomer från substrat i mikrobiella biomarkörer, såsom fosfolipid härrörande från fettsyror, DNA och RNA ^5. När man överväger nukleinsyror, är den metod som baseras på separation av ¹³ C-märkt DNA eller RNA från den omärkta DNA genom densitet-gradient ultracentrifugering ^6. På grund av denna direkta förbindelse mellan den DNA-etikett och metabolisk aktivitet, en nedströms molekylär analys av nukleinsyrorna identifierar arten och ger information om metaboliska aktiviteter. Dessutom är kombinationen av DNA-SIP och pyrosekvensering som tillämpas avPilloni von Netzer, et al. ^15, medger en viss enkel och känslig identifiering av bakteriearter som finns i den tunga ¹³ C-märkt DNA-fraktionen. Hittills har denna teknik använts för att beskriva de bakteriella samhällen som deltar i biogeokemiska processer i marken under aeroba ^16,17 och anaeroba förhållanden ^18,19. Vid sidan av användningen i miljövetenskap, har tekniken använts i medicinska vetenskaper som rapporterats av Reichardt, et al. ^5, som beskrev den metaboliska aktiviteter av olika fylogenetiska grupper av den mänskliga tarmfloran som svar på en icke-smältbar kolhydrat.

Här använder vi ¹³ C-glukos till "etikett" DNA av de metaboliskt aktiva bakteriearter i tarmen. Glukos är en sockerart som används av de flesta bakteriearter längs den utbredda Entner-Doudoroff (ED) vägen, även om undantag är kända ^20. Dettamotiverar användningen av ¹³ C-glukos som en pålitlig metabolisk sond som ger ett samband mellan metaboliter av intresse och kolkälla längs etablerade vägar. Beroende på den vetenskapliga frågan, andra substrat, dvs ¹³ C-metan, ¹³ _CO2, eller växter som fötts upp under en ¹³ CO ₂ atmosfär, kan användas för att behandla metaboliska aktiviteter.

Vid denna punkt, presenterar vi det protokoll som används i den metaboliska karakterisering av tarmen bakteriell gemenskap av en generalist insekt, nämligen S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Dessutom var den teknik kopplad till pyrosekvensering, vilket i sin tur gör det möjligt att identifiera insekts tarm bakteriell gemenskap med hög upplösning och precision. Eftersom det huvudsakliga substratet var ¹³ C-märkt glukos användes under experimenten.

Protocol

1. Insekt Uppfödning Köpa eller få ägg kopplingar av Spodoptera littoralis från din egen uppfödning. Behåll dem i sterila petriskålar i rumstemperatur (RT) till kläckning. Förbered artificiella dieten för insekterna föder upp enligt följande: Blöt 500 g malda vita bönor över natten i 100 ml vatten. Lägg 9,0 g askorbinsyra och 75 g agar till 1000 ml destillerat H2O och därefter koka den. Låt blandningen svalna och när det stelnar (t…

Representative Results

För att uppnå tillräcklig märkning av de metaboliskt aktiva bakterier som finns i insekts tarmen måste insekten att exponeras för de 13 C-rika substrat för ett tidigare optimerade period som är tillräcklig för att möjliggöra separation av det märkta tyngre fraktionen lätt från den omärkta ljusare en. I vårt fall var 13 C-glukos kompletterat i den konstgjorda dieten vid en slutlig koncentration av 10 mM under 1 dag (Figur 1A). Samma mängd normal glukos (Fig…

Discussion

Tarmen hos de flesta insekter hyser en rik och komplex mikrobiella, typiskt 10 ⁷ -10 ⁹ prokaryota celler lämna där, outnumbering värdens egna celler i de flesta fall. Således är insekten tarmen en "hot spot" för olika mikrobiella aktiviteter, som representerar flera aspekter av mikrobiella relationer, från patogenes att obligat mutualism ^27. Även om många studier har beskrivit ett fantastiskt utbud av insekts tarmen mikrobiella samhällen, karaktärisering av den metab…

Materials

Dumont #5 Mirror Finish Forceps	Fine Science Tools	11251-23
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
Speed Vacuum Concentrator 5301	Eppendorf Germany	5305 000.304
Plastic pestle	Carl Roth GmbH Co. Germany	P986.1
NanoVue spectrophotometer	GE HealthCare, UK	28-9569-58
Mastercycler pro/thermocycler	Eppendorf Germany	6321 000.515
Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber	Biometra	Discontinued
Ultracentrifuge (Optima L-90K)	Beckman	A20684
Ultracentrifuge rotor (NVT 90)	Beckman	362752
HPLC pump	Agilent	1100
Quick-Seal, Polyallomer tube	Beckman	342412
Transilluminator UVstar 15	Biometra