Identifisering av metabolsk aktiv bakterier i tarmen av generalist<em> Spodoptera littoralis</em> Via DNA stabile isotoper Verifiserer Bruke¹³ C-Glukose

Summary

Den aktive bakterie fellesskap forbundet med tarmen av Spodoptera littoralis, ble bestemt ved stabil-isotop-sentret (SIP) som er koplet til pyrosequencing. Ved hjelp av denne metoden, ble identifisering av metabolsk aktive bakterier arter i samfunnet gjort med høy oppløsning og presisjon.

Abstract

Guts av de fleste insekter er bebodd av komplekse samfunn av symbiotiske nonpathogenic bakterier. Innenfor slike mikrobielle samfunn er det mulig å identifisere commensal eller mutualistic bakteriearter. De sistnevnte, har blitt observert å tjene flere funksjoner i insektet, dvs. hjelpe i insekt reproduksjon ^1, øker immunresponsen ^2, feromon produksjons ^3, samt ernæring, inkludert syntese av essensielle aminosyrene ^4, blant andre.

På grunn av betydningen av disse foreningene, er mange anstrengelser er gjort for å karakterisere lokalsamfunnene ned til de enkelte medlemmene. Men de fleste av disse tiltakene ble enten basert på dyrkingsmetoder eller støttet seg på generering av 16S rRNA genet fragmenter som ble sekvensert for endelig identifisering. Dessverre er disse metoder bare identifisert de bakterielle arter som er tilstede i tarmene, og forutsatt ingen information på metabolsk aktivitet av mikroorganismene.

Å karakterisere metabolsk aktive bakteriearter i tarmen av et insekt, brukte vi stabile isotop sondering (SIP) in vivo ansette ¹³ C-glukose som en universell substrat. Dette er et lovende kultur-fri teknikk som gjør det mulig for koblingen av mikrobielle phylogenies til deres spesielle metabolske aktivitet. Dette er mulig ved å spore stabile isotop-merket atomer fra substrater til mikrobielle biomarkører, slik som DNA og RNA ^5. Inkorporering av ¹³ C isotoper i DNA øker tettheten av det merkede DNA sammenlignet med umerket ⁽¹² C) en. Til slutt er det ¹³ C-merket DNA-eller RNA separert ved densitets-gradient-ultrasentrifugering fra ¹² C-umerket lignende en ^6. Etterfølgende molekylær analyse av de separerte nukleinsyre isotopomers gir sammenhengen mellom metabolsk aktivitet og identiteten til arten.

Her presenterer vi en protokoll som brukes til å karakterisere de metabolsk aktive bakterier i tarmen av en genera insekt (vår modellsystem), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). De fylogenetisk analyse av DNA ble utført ved hjelp av pyrosequencing, som tillater høy oppløsning og nøyaktighet i identifisering av insekt tarmbakteriemiljøet. Som viktigste substrat, ble ¹³ C-merket glukose anvendt i eksperimentene. Substratet ble matet til insektene ved hjelp av en kunstig diett.

Introduction

Insekt-bakterielle symbiotiske foreninger er kjent for et stort antall insektarter ^7. I disse symbiotiske foreninger, mikroorganismer spiller viktige roller i vekst og utvikling av insekter. Mikrober har vist seg å bidra til en insekt reproduksjon ^1, feromon biosyntese ^3, ernæring, inkludert syntese av essensielle aminosyrer ^{til 4,} og fordøyelsen av mat utilgjengelige til verten. Til tross for den enorme utvalg av gut-bakteriell foreninger, er mye mindre kjent om den funksjonelle rollen de spiller i favør av insekt. Bare i tilfelle av termitter, det symbiotiske fordøyelsen av lignocellulose utført av prokaryoter, protozoer og sopp, har vært mye studert ^8,9. I kontrast til dette, er lite kjent om det symbiotiske foreningen til stede i tarmen av genera insekter dvs. bomull leafworm, littoralis Spodoptera. Videre, på grunn av deres hyppige skift av plante verter, generalist insekter og deres gut forbundet bakteriesamfunn er permanent utsatt for nye utfordringer knyttet til deres matvanene forbruker planter med en mengde fytokjemikalier. Foruten dette, tarmmiljøet i sommerfugler, utgjør i seg selv et barskt miljø for vekst av bakterier på grunn av den høye pH ¹⁰ tarmen. Spesielt i tilfelle av S. littoralis, varierer det fra 10,5 i forutgående, ca. 9 i midgut til pH nesten 7 i hindgut ^11. På den annen side, den bakterielle fellesskap forbundet med tarmen S. littoralis er enkel. Tang, Freitak, et al. ^12. rapportert maksimalt 36 phylotypes hører til totalt 7 forskjellige bakteriearter som bare medlemmer av bakterie fellesskap forbundet med dette insekt. I tillegg til dette, er ikke noe komplisert oppdrett prosedyre kreves for insektvekst i laboratoriet. Videre er dette og den korte levetid av insekt lette multi-generational studier, snu denne arten til en ideell modell for å studere gut-mikrobe interaksjoner.

Med bruk av PCR-basert sekvensering teknologier, har antall studier som omhandler gut biota av flere organismer (dvs. mennesker, insekter, eller marine organismer) økt. Videre resultatene er uavhengige fra isolasjon og dyrking av tarm næret bakterier som i det siste. Nesten 99% av bakterier er ikke dyrkbar og simulering av miljøforholdene som råder i tarmen er vanskelig ^tolv. Ved hjelp av PCR, kunne 16S rRNA genet fragmenter (et mye brukt fylogenetisk gente blant bakterier) selektivt forsterket fra en blandet DNA mal av gut bakteriesamfunn, sekvensert, og klonet. Med denne informasjonen, er brukeren i stand til å identifisere de bakteriearter etter henting sekvensen informasjon fra offentlige databaser ^13,14. Likevel nærmer seg sekvensering for å beskrive bakteriellsamfunnene fortsatt utilstrekkelig på grunn av manglende informasjon om den iboende metabolske bidrag av de enkelte arter i samfunnet.

Stabil-isotop sondering (SIP) er en lovende kultur-fri teknikk. Det er ofte brukt i miljømikrobiologi å analysere mikrobielle phylogenies knyttet til bestemte metabolske aktiviteter. Dette oppnås ved å spore stabile isotop-merket atomer fra substrater til mikrobielle biomarkører som fosfolipid-avledede fettsyrer, DNA og RNA ^5. Ved vurdering av nukleinsyrer, er metoden basert på separasjon av ^13C-merket DNA eller RNA fra umerket DNA med densitet gradient-ultrasentrifugering ^6.. På grunn av den direkte forbindelse mellom DNA-etikett og metabolske aktivitet, en nedstrøms molekylær analyse av nukleinsyrene identifiserer arten og gir informasjon om metabolske aktiviteter. Videre kombinasjon av DNA-SIP og pyrosequencing som anvendes avPilloni, von Netzer, et al. ^15, tillater en særlig enkel og sensitiv identifisering av bakterielle arter tilstede i den tunge ¹³ C-merket DNA-fraksjon. Inntil nå, har denne teknikken er brukt for å beskrive de bakteriesamfunn involvert i biogeokjemiske prosesser i jord under aerobe ^16,17 og anaerobe forhold ^18,19. I tillegg til bruk i miljø, har teknikken blitt anvendt i medisinsk vitenskap som rapportert av Reichardt, et al. ^Fem, som beskrev de metabolske aktiviteter av forskjellige fylogenetiske grupper av den menneskelige tarmfloraen som reaksjon på et ikke-fordøyelig karbohydrat.

Her benyttes ^13C-glukose til å "label" DNA av metabolsk aktive bakteriearter i tarmen. Glukose er en sukker benyttes av de fleste bakterielle arter langs den utbredte Entner-Doudoroff (ED) veien, selv om unntak er kjent ^20. Detterettferdiggjør bruk av ^13C-glukose som en pålitelig metabolsk sonde som gir en kobling mellom metabolitter av interesse og karbonkilden langs etablerte veier. Avhengig av den vitenskapelig spørsmålet andre substrater, dvs. ¹³ C-metan, ¹³ CO ₂ eller planter hevet under en ¹³ _CO2 atmosfære, kan brukes til å adressere metabolske aktiviteter.

På dette punktet, presenterer vi protokollen brukt i metabolsk karakterisering av tarmen bakteriell fellesskap av en generalist insekt, nemlig S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Videre ble teknikk koplet til pyrosequencing, som igjen tillater identifisering av insekt tarmbakterie fellesskap med høy oppløsning og nøyaktighet. Som det viktigste substrat, ble ¹³ C-merket glukose benyttet under forsøkene.

Protocol

En. Insect stell Kjøpe eller få egg klørne til Spodoptera littoralis fra ditt eget oppdrett. Holde dem i sterile petriskåler ved romtemperatur (RT) før klekking. Forbered kunstig diett for insekter oppdrett som følger: Sug 500 g malte hvite bønner over natten i 100 ml vann. Til 9,0 g askorbinsyre og 75 g agar i 1000 ml destillert H2O, og deretter koke den. La blandingen avkjøles, og når det størkner (til et hvitt voksaktig faststoff-blanding…

Representative Results

For å oppnå tilstrekkelig merking av metabolsk aktive bakterier tilstede i insekt tarmen, må insektet utsettes for de 13 C-rikt substrat for en tidligere optimalisert periode som er tilstrekkelig til å tillate separasjon av den merkede tyngre fraksjon lett fra den umerkede lysere en. I vårt tilfelle var 13 C-glucose supplert i kunstig diett i en endelig konsentrasjon på 10 mM i 1 time (figur 1A). Den samme mengde av normal glukose (figur 1B) ble levert i kuns…

Discussion

Tarmen av de fleste insekter havner en rik og kompleks mikrobielle samfunn, vanligvis 10 ⁷ -10 ⁹ prokaryote celler losjere det, outnumbering vertens egne celler i de fleste tilfeller. Dermed er insekt gut en "hot spot" for ulike mikrobielle aktiviteter, som representerer flere aspekter av mikrobielle forhold, fra patogenesen å forplikte mutualism ^27. Selv om mange studier har beskrevet en utrolig variasjon av insekt gut mikrobielle samfunn, karakterisering av metabolsk aktivit…

Materials

Dumont #5 Mirror Finish Forceps	Fine Science Tools	11251-23
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
Speed Vacuum Concentrator 5301	Eppendorf Germany	5305 000.304
Plastic pestle	Carl Roth GmbH Co. Germany	P986.1
NanoVue spectrophotometer	GE HealthCare, UK	28-9569-58
Mastercycler pro/thermocycler	Eppendorf Germany	6321 000.515
Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber	Biometra	Discontinued
Ultracentrifuge (Optima L-90K)	Beckman	A20684
Ultracentrifuge rotor (NVT 90)	Beckman	362752
HPLC pump	Agilent	1100
Quick-Seal, Polyallomer tube	Beckman	342412
Transilluminator UVstar 15	Biometra