פלישת חיידקי enteric של תאי אפיתל במעי<em> במבחנה</em> באופן דרמטי משופר תוך שימוש במודל לשכת דיפוזיה אנכי
Summary
ביצוע מבחני תרבית תאים לחקירת הידבקות ופלישה חיידקים בתנאים אירוביים הוא בדרך כלל בלתי מייצג של<em> In vivo</em> איכות סביבה. מודל קאמרי דיפוזיה אנכית מאפשר מחקר של אינטראקציות של הפתוגן האנושי<em> קמפילובקטר jejuni</em> עם תאי אפיתל במעי תחת יותר<em> In vivo</emדמוי> תנאים, וכתוצאה מפלישת חיידקים משופרת.
Abstract
האינטראקציות של חיידקים פתוגנים עם תאי מארח נחקרו בהרחבה שימוש בשיטות תרבות תאים במבחנה. עם זאת כמבחני תרבית תאים מסוג זה מבוצעים בתנאים אירוביים, אלה במודלים חוץ גופית עשויים שלא לייצג במדויק בסביבת vivo שבאינטראקציות בין המאכסן לפתוגן תתקיים. פיתחנו מודל חוץ גופית בזיהום המאפשר coculture של חיידקים ותאים מארחים בתנאי גז בינוני ושונה. לשכת דיפוזיה אנכית (VDC) מודל מחקה את התנאים במעי האנושי שבו חיידקים יהיו בתנאים של רקמות תוך חמצן נמוכים מאוד יהיה מסופק עם חמצן מזרם הדם. הצבת מקוטבת סלולרי (IEC) monolayers אפיתל במעי גדלה במוסיף Snapwell לVDC יוצרת תאי apical וbasolateral נפרדים. תא basolateral מלא בתרבית תאים בינונית, אטום וperfused עם החמצן whilst תא הפסגה מלא במרק, כל הזמן פתוח וטופחו בתנאי microaerobic. יכול להישמר גם קאקו-2 וT84 IECs בVDC בתנאים אלה ללא כל השפעות מזיקות לכאורה על הישרדות תא או שלמות שכבה. ניסויי Coculturing הופיעו עם ג שונה זני הבר מסוג jejuni וקווים שונים של חברת חשמל במודל VDC עם תנאי microaerobic בתא הפסגה לגרום reproducibly בעלייה במספר של אינטראקציה (כמעט פי 10) והתאיים (חיידקים כמעט פי 100) בהשוואה לתנאי תרבות אירוביות 1. הסביבה שנוצרה במודל VDC מחקה את הסביבה נתקל על ידי C. באופן הדוק יותר jejuni במעי האנושי, ומדגיש את החשיבות של ביצוע מבחני בזיהום חוץ גופית בתנאים המחקים באופן הדוק יותר במציאות vivo. אנו מציעים כי השימוש במודל VDC יאפשר פרשנויות חדשות של יחסי הגומלין מתערבתWeen חיידקים פתוגנים ותאי מארח.
Introduction
האינטראקציות של חיידקים פתוגנים עם תאי מארח נחקרו בהרחבה שימוש בשיטות תרבות תאים במבחנה. באמצעות מבחני כאלה סלולריים תרבות, הידבקות חיידקים לתאי מארח, זיהוי של קולטני תא מארח, תא מארח מסלולי איתות ופלישת חיידקים של תאי מארח כל נחקרו בפירוט, וכתוצאה מתצפיות רבות וחשובות. עם זאת מבחני תרבית תאים מסוג זה מבוצע בתנאים אירוביים כי לא יכול להיות נציג בסביבת vivo. מגבלה עיקרית של שימוש במודלים חוץ גופית ללמוד זיהומים במערכת העיכול היא שתנאי תרבות רמות חמצן גבוהים, כולל בדרך כלל מעדיפים הישרדות תא אוקריוטים. עם זאת תנאים בחלל המעי יהיו כמעט אנאירובי. פתוגנים מעיים בסביבת חמצן נמוכה מאוד לבטא גנים ארסיות ביטוי שינויים 2 בתנאים אירוביים. ככזה, נתונים שהושגו באמצעות תקן תא תרבות מודלים מ 'איי לתת אינדיקציה מדויקת של יחסי גומלין עם חיידקי תאי מארח.
קמפילובקטר jejuni הוא סוכן הסיבה המוביל של קיבה ומעיים חריפות חיידקים ברחבי העולם, עם תסמינים שנעו בין שלשול קל עד מעיים דלקתיים קשים. רוב ג תוצאת זיהומים במערכת העיכול jejuni לא מסובכת, עם זאת ג jejuni הוא גם הגורם המדבק המזוהה לרוב בנוירופתיה היקפית כולל תסמונת גייךבאךה (GBS). בבריטניה, הערכה הוא כי ישנם מעל 500,000 מקרים של דלקת מעיים הנגרמים על ידי C. jejuni זיהום בכל שנה עם עלות צפויה לכלכלת בריטניה של 580,000,000 £. בעולם המתפתח, ג jejuni הוא גורם מוביל לתמותה בקרב ילדים. למרות החשיבות המוטלת בספק של זיהום קמפילובקטר ועשרות שנים של מחקר, כולל ניתוח המבוסס על גנומיקה יסודי, ג פתוגנזה jejuni עדיין גרוע understOOD, בניגוד לפתוגנים אחרים מעיים כגון סלמונלה, Escherichia coli, Shigella, וVibrio cholerae. חוסר מודל חיה קטן נוח הוא אחת סיבות עיקרית לזה 3. גם בשימוש נרחב במודלים של זיהום מבחנה אינם מתאימים יותר ללימוד ג microaerophilic jejuni מאשר לפתוגנים מעיים אחרים, כי הם אנאירוביים הפקולטטיביים. בעוד ג jejuni מוכר כמחולל מחלה פולשנית, את המנגנונים של ג פלישת jejuni של תאי אפיתל במעי (IECs) עדיין אינה ברורה 4,5. ג פלישת jejuni הוכח להיות תלויה משני סיבים מיקרוסקופים, Microtubules, שילוב של שניהם או אף אחד 5. הבלבול בתחום זה הוא ככל הנראה בשל השימוש בלתי הולם בתנאים של assay חוץ גופית.
מספר מבחני תרבית תאים השונים היה בשימוש כדי לחקור את האינטראקציות של ג jejuniעם תאי מארח. קאקו-2 6, כולם היו בשימוש 407 7, וT84 8 שורות תאי INT ללמוד את ההידבקות ופלישה היכולות של ג שונה זני jejuni. עם זאת, ברמות של הידבקות ופלישה חיידקים לג jejuni עם IECs נמוך יותר באופן משמעותי מאשר לפתוגנים מעיים 9 אחרים. Coculturing של ג jejuni עם IECs בדרך כלל מתבצע בCO 2 באינקובטור בתנאים קרובים לרמות חמצן באטמוספרה, הנדרש להישרדותו של IECs. ג ביטוי גני jejuni יהיה שונה מאוד בסביבת החמצן הנמוכה של חלל המעי בהשוואה לתנאי חמצן אטמוספרי.
השימוש במערכת קאמרית דיפוזיה אנכית (VDC) פותח המאפשרת coculture של חיידקים ותאים מארחים בתנאי גז 1,10,11 בינוניות ושונה. מערכת זו מחקה את התנאים במעי האנושי שבו חיידקים יהיו בלתיתנאי דר ושל רקמות תוך חמצן נמוכים מאוד יסופקו עם חמצן מזרם הדם. monolayers חברת החשמל מקוטבות שגודלו במסנני מיקרומטר 0.4 מיוחדים הושמו לVDC יצירת תא הפסגה וbasolateral, שהיו מלא באופן אישי עם מרק חיידקים ותרבית תאים בינוני בהתאמה (איור 1). VDC הוצב לאטמוספרה משתנה חממה המכילה 85% N 2, 5% O 2, ו-CO 2 10% על 37 מעלות צלזיוס, המייצגת את התנאים אופטימליים לג jejuni. תא הפסגה נותר פתוח וחשוף לאווירת microaerobic בתוך אווירת החממה משתנה, בעוד שהתא האטום basolateral סופק עם חמצן על ידי ממשל קבוע של 5% CO 2/95% O 2 תערובת גז עם צינור מוצא מניעת הצטברות של לחץ . קאקו-2 הישרדות תא והיושרה monolayer בתנאים אלה אושרו על ידי ניטור ele transepithelialהתנגדות ctrical (TEER) על פני monolayer מעל 24 שעות כדי להוכיח קיומו של קאקו-2 monolayer התא וההפרדה הפיסית של תאי apical וbasolateral בתנאי חמצן נמוכים בתא הפסגה. TEER של monolayers בVDCs נשמר באווירת החממה משתנה (תנאי microaerobic) וברמת תא תרבות CO 2 באינקובטור (תנאים אירוביים) לא הראה הבדלים משמעותיים, המצביע על יושרה של monolayer התא בתנאים אטמוספריים שונים 1. בתנאי microaerobic, צמתים הדוקים נותרו בהווה ובמתחלק באופן שווה בין גבולות תאים עם דפוס מכתים occludin דומה לתאי קיומם תחת תנאים אירוביים 1.
האינטראקציות של ג jejuni עם קאקו-2 וT84 תאים בVDC נחקרו על ידי בחינת אינטראקציה חיידקים (הידבקות ופלישה) ופלישה. שניים ג שונה jejuni פראי סוג straiNS שמשו 1. ג jejuni 11168H הוא נגזר של hypermotile רצף הזן המקורי NCTC11168. זן 11168H מראה רמות גבוהות הרבה יותר קולוניזציה במודל הקולוניזציה אפרוח, והוא נחשב למתח מתאים לשימוש במחקרי אינטראקציה בין מאכסן לפתוגן וכך. 81-176 הוא אדם בודד והוא אחד מזני המעבדה למדו נרחב ביותר פולשניים. ג זני jejuni נוספו לתא apical של VDC או תחת תנאי microaerobic או אירוביים. אנו נצפו שיעור גבוה יותר עבור שניהם אינטראקציה ופלישה נרשמו לג jejuni בתנאי microaerobic 1. ג המוגבר אינטראקציות jejuni לא היו כתוצאה מגידול במספרי חיידקים בתנאי microaerobic 1. הנתונים אלה תומך בהשערה שלנו שסביבת החמצן הנמוכה בתא apical של VDC משפרת אינטראקציות חיידקים מארחות ומצביעה על כך שהמאפיינים פולשני של ג jejuni הוא incrהקל בתנאים אלה. זה היה הדו"ח הראשון של השימוש במודל VDC ללמוד פתוגן חיידקים חודרני ומדגיש את החשיבות של ביצוע מבחני בזיהום חוץ גופית בתנאים המחקים במצב vivo באופן הדוק יותר. מודל VDC יכול לשמש כדי לחקור את יחסי הגומלין בין מאכסן לפתוגן למיני חיידקים רבים ושונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש בשיטות תרבות תאים במבחנה כדי לחקור את יחסי הגומלין של חיידקים פתוגנים עם תאי מארח הוא טכניקה מועסקות באופן נרחב במעבדות מחקר רבות. עם זאת כמבחני תרבית תאים מסוג זה מבוצעים בתנאים אירוביים, אלה במודלים חוץ גופית עשויים שלא לייצג במדויק בסביבת v…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
דומיניק מילס נתמכה על ידי בלומסברי מכללות PhD Studentship (2007-2010). המחברים מבקשים להודות לשניהם Gundogdu האוזן ועאבדי Elmi על סיועם בפיתוח מודל VDC.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
- Mills, D. C., et al. Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment. Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).
- Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465, 355-358 (2010).
- Dorrell, N., Wren, B. W. The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).
- Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).
- Hu, L., Kopecko, D. J., Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. Chapter 17. Campylobacter. , 297-313 (2008).
- Everest, P. H., et al. Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli. J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).
- Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures. Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).
- Monteville, M. R., Konkel, M. E. Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface. Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).
- Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms. J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).
- Schuller, S., Phillips, A. D. Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells. Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).
- Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling. J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).
