肠道细菌侵入肠上皮细胞<em>体外</em>使用垂直扩散室模型，显着增强
Summary
在有氧条件下进行细胞培养实验调查细菌的粘附和侵袭，通常是不具代表性的<em>在体内</em>环境。 A垂直扩散室模型允许人类病原体的相互作用研究<em>空肠弯曲菌</em与肠上皮细胞在更<em>在体内</em>如条件，从而增强细菌的侵袭。
Abstract
与宿主细胞的细菌性病原体的相互作用已被广泛研究，利用体外细胞培养方法。然而，由于这样的细胞培养实验是在有氧条件下进行的，这些在体外模型中，可能无法精确地表示在体内环境，使宿主病原体相互作用发生。我们已经开发出了不同的介质和气体条件下，允许细菌与宿主细胞的共培养感染的体外模型。厅（VDC）的垂直扩散模型模拟人体肠道的条件下，细菌会在那里将提供与从血液中的氧的条件下，是非常低的氧，而组织。配售极化肠上皮细胞（IEC）单层生长成VDC在Snapwell插入心尖和基底创建单独的车厢。基底外侧的隔室充满了细胞培养液中，密封，灌注与氧瓦特休斯特根尖车厢充满了肉汤，保持开放和微氧条件下培养。双方的Caco-2和T84的IEC可以维持在直流电压，在这些条件下，对细胞的存活或单层的完整性没有任何明显的不利影响。共培养实验进行不同C.空肠弯曲菌的野生型菌株和不同的IEC线VDC模型再现性与微需氧条件下在心尖室产生相互作用的数量（近10倍）的增加和细胞内细菌（近100倍）相比，有氧培养条件1。 VDC模型中创建的环境更加紧密地模仿环境C.遇到在人体肠道菌和突出表演体外感染实验条件下，更加紧密地模仿在体内现实中的重要性。我们建议，使用的VDC模型将允许下注的相互作用的新诠释WEEN细菌病原体和宿主细胞。
Introduction
与宿主细胞的细菌性病原体的相互作用已被广泛研究，利用体外细胞培养方法。使用这样的细胞培养实验中，细菌宿主细胞的粘附性，鉴定的受体宿主细胞，宿主细胞的信号转导途径和细菌入侵宿主细胞都被详细研究，导致在许多重要的观测。然而，这样的细胞培养实验是在有氧条件下，可能不具有代表性的体内环境。 在体外模型用来研究胃肠道感染是一个主要的限制，文化条件，包括高氧含量普遍青睐真核细胞的存活。然而，在肠腔内的条件下将几乎是厌氧的。在一个非常低的氧环境下的肠道病原体表达的毒力基因的表达在有氧条件下的变化2。因此，获得的数据，使用标准的细胞培养模型M可能给出不准确的指示细菌与宿主细胞的相互作用。
空肠弯曲菌是细菌性急性胃肠炎全球领先的病原体，症状范围从轻度腹泻到严重的炎症性肠炎。 C.大多数空肠弯曲菌感染导致并发症的胃肠炎，但是C.空肠弯曲菌是最常见的周围神经病变，包括格林-巴利综合征（GBS）的传染性病原体。据估计，在英国，有超过50万的情况下，引起肠炎C.菌感染，每年对英国经济的预测成本5.8亿英镑。在发展中世界，C.菌是儿童死亡的首要原因。尽管无疑是十分重要的弯曲杆菌感染和几十年的研究，包括彻底的基于基因组学的分析，C.菌的发病机制仍是不佳understOOD，对比其他肠道致病菌如沙门氏菌 ， 大肠杆菌 ， 痢疾杆菌 ， 霍乱弧菌 。一个方便的小动物模型的缺乏是其中一个主要原因，这3。此外，广泛应用于体外感染模型更不适用于研究微需氧C.菌比其他肠道致病菌，兼性厌氧菌。虽然C。菌侵入的病原体，机制C.确认为菌侵入肠上皮细胞（IECS）目前仍不清楚。C. 4,5 空肠弯曲菌侵袭已被证明是依赖于以微丝，微管，两者的组合或两者都不是5。在这方面的混乱，最有可能是由于在体外试验条件下的使用不恰当的。
已使用的许多不同的细胞培养实验，调查C的相互作用菌与宿主细胞。 Caco-2细胞，INT 407 7，T84 8芯线都被用于研究不同C.黏附和侵袭能力菌菌株。不过，该水平的细菌粘附和入侵C.空肠弯曲菌与IECS是大大低于其他肠道病原体9。共培养C.空肠弯曲菌与IECS通常是附近的大气中的氧水平的条件下，在CO 2培养箱中进行，所需的生存的IEC C。空肠弯曲菌基因表达会有很大的不同，在低氧气的环境相比，大气中的氧气条件下肠腔。
已开发的垂直扩散商会系统（VDC）的使用，它允许根据不同的介质和气体条件1,10,11细菌与宿主细胞的共培养。该系统模拟的条件在人体肠道中的细菌将被取消从血液中的氧会被提供一个非常低的氧，而组织的性别条件。有极性的IEC单层生长在特殊的0.4μm的过滤器被放置成一个直流电压，创建心尖和基底的隔室，与细菌的发酵液和细胞培养基中（ 图1），并分别填充。的直流电压被放入变量的气氛含有85％N 2，5％O 2，和10％的CO 2培养箱在37℃下，较下的最佳条件为空肠弯曲菌 。心尖室敞开和变量气氛培养箱内暴露于微氧气氛，而密封的基底外侧隔室与氧气的供给恒定给药5％CO 2/95％O 2的混合气体与出口管防止压力积累。获确认通过监测跨膜元素，Caco-2细胞的生存和在这些条件下的单层的完整性跨单层超过24小时ctrical电阻（TEER），以证明生存的Caco-2细胞单层和物理分离的心尖和基底低氧条件下在心尖的隔室的隔室。单层TEER在变量的气氛孵化器（微氧条件）和标准的细胞培养CO 2培养箱（有氧条件下）保持在VDC的没有表现出显着性差异，表明细胞单层的完整性不同大气条件下1。微氧条件下，紧密连接仍然存在occludin的染色模式类似于细胞维持在有氧条件下1单元格边框之间均匀分布。
C.的相互作用空肠弯曲菌与Caco-2细胞和T84细胞在VDC进行了研究，通过评估细菌相互作用（粘附和侵袭）和侵袭。两种不同的C。菌野生型笔直NS 1。C.空肠弯曲菌 11168H是一个hypermotile的的原始序列菌株NCTC11168的衍生物。 11168H应变显示在一个小鸡定植模型定植水平高得多，因此被认为是一个合适的菌株用于宿主 – 病原体相互作用的研究。 81-176是人类的隔离是最侵入性的广泛的研究的实验室菌株之一。C.空肠弯曲菌菌株中加入微需氧或好氧条件下向根尖隔室的一个直流电压。我们观察到互动和侵袭率较高C.录菌微氧条件下1。 C.增加菌相互作用不是由于细菌数量增加，微氧条件下1。在心尖的隔室中的VDC的低氧环境中增强了细菌宿主的相互作用，并指示此数据支持了我们的假设，C.侵入性的性质的空肠弯曲菌是增量在这些条件下的缓解。这是首次报告使用的VDC模型研究侵袭性细菌病原体，并进行体外感染实验条件下，更加紧密地模仿体内的情况突出的意义。 VDC模型可以用来研究许多不同的细菌宿主 – 病原体相互作用。
Protocol
Representative Results
Discussion
研究细菌病原体与宿主细胞的相互作用是在体外细胞培养的方法，使用广泛采用的一种技术，在许多研究实验室。然而，由于这样的细胞培养实验是在有氧条件下进行的，这些在体外模型中，可能无法精确地表示在体内环境，使宿主病原体相互作用发生。 在体外感染模型被广泛使用的是特别不合适的学习微需氧C.菌相比其他肠道致病菌，兼性厌氧菌。在文献中有?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
多米尼克·米尔斯由布卢姆斯伯里高校博士助学金（2007-2010年）的支持。笔者想感谢他们协助开发的VDC模型的OZAN Gundogdu和阿卜迪·艾尔米。
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
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