Enteriske Bakteriel invasion af tarmepitelceller<em> In Vitro</em> Er dramatisk forøget hjælp af en lodret diffusionskammer Model
Summary
Udførelse celledyrkningsassays til at undersøge bakteriel vedhæftning og invasion under aerobe forhold er normalt ikke repræsentativt for<em> In vivo</em> Miljø. En lodret diffusionskammer model tillader undersøgelse af interaktioner mellem det humane patogen<em> Campylobacter jejuni</em> Med tarmepitelceller under mere<em> In vivo</em>-Lignende forhold. Resulterer i øget bakteriel invasion
Abstract
Vekselvirkninger bakterielle patogener med værtsceller er undersøgt omfattende anvendelse af in vitro cellekultur metoder. Men sådanne celledyrkningsassays udføres under aerobe betingelser, disse in vitro-modeller kan ikke nøjagtigt repræsentere in vivo miljø, i hvilket værtspatogene interaktioner finder sted. Vi har udviklet en in vitro model af infektion, der tillader cokultur af bakterier og værtsceller under andet medium og gassen. Lodret diffusionskammer (VDC) model efterligner betingelserne i den menneskelige tarm, hvor bakterierne vil være under betingelser med meget lavt iltindhold, mens væv kan forsynes med ilt fra blodet. Anbringelse polariserede intestinale epitelceller (IEC) monolag dyrket i Snapwell indsætter i en VDC skaber separate apikale og basolaterale rum. Den basolaterale rum er fyldt med celledyrkningsmedium, forseglet og gennemskyllet med ilt wHilst den apikale rum er fyldt med bouillon, holdes åben og inkuberet under mikroaerobe betingelser. Både Caco-2 og T84 IECS kan opretholdes i VDC under disse betingelser, uden nogen tilsyneladende skadelige virkninger på celle overlevelse eller monolag integritet. Coculturing eksperimenter udført med forskellige C. jejuni vildtypestammer og forskellige IEC linjer i VDC modellen med mikroaerobe forhold i det apikale kammer reproducerbart resultere i en stigning i antallet af interagerende (næsten 10-fold) og intracellulære (næsten 100 gange) bakterier sammenlignet aerobe dyrkningsbetingelser 1.. Miljøet skabt i VDC-modellen mere nøje efterligner miljøet stødt af C. jejuni i den menneskelige tarm og fremhæver vigtigheden af at udføre in vitro infektion assays under betingelser, der mere nøje efterligner in vivo virkelighed. Vi foreslår, at brug af VDC-modellen vil give nye fortolkninger af samspillet betlem bakterielle patogener og værtsceller.
Introduction
Vekselvirkninger bakterielle patogener med værtsceller er undersøgt omfattende anvendelse af in vitro cellekultur metoder. Brug af disse celledyrkningsassays, bakteriel vedhæftning til værtsceller, identifikation af værtscellereceptorerne, værtscelle signalveje og bakteriel invasion af værtsceller er alle blevet undersøgt i detaljer, hvilket resulterer i mange vigtige iagttagelser. Men sådanne celledyrkningsassays er udført under aerobe forhold, som måske ikke er repræsentative for in vivo miljø. En væsentlig begrænsning af in vitro-modeller, der anvendes til at studere gastrointestinale infektioner er, at dyrkningsbetingelser herunder høje iltindhold generelt går eukaryot celle overlevelse. Men forhold i tarmen vil være næsten anaerobe. Enteropatogener i en meget lav ilt miljø udtrykker virulensgener hvis ekspression ændringer under aerobe forhold 2.. Som sådan kan data ved hjælp af standard cellekultur modeller may give et forkert indikation af bakterielle interaktioner med værtsceller.
Campylobacter jejuni er den førende agens af bakteriel akut gastroenteritis på verdensplan, med symptomer, der spænder fra mild diarré til svær inflammatorisk tarmbetændelse. Størstedelen af C. jejuni infektioner resulterer i ukompliceret gastroenteritis, dog C. jejuni er også den hyppigst identificerede smitstof i perifere neuropatier, herunder Guillain-Barré syndrom (GBS). I Storbritannien anslås det, at der er over 500.000 tilfælde af enteritis forårsaget af C. jejuni-infektion hvert år med et forventet udgifter for den britiske økonomi £ 580.000.000. I udviklingslandene, C. jejuni er en førende dødsårsag blandt børn. Trods den ubestridelige betydning Campylobacter infektion og årtiers forskning, herunder en grundig genomics-baseret analyse, C. jejuni patogenese er stadig dårligt understood, i modsætning til andre enteriske patogener, såsom Salmonella, Escherichia coli, Shigella, og Vibrio cholerae. Manglen på en bekvem lille dyr model er en væsentlig årsag til dette 3. Også meget udbredt i vitro infektion modeller er mere uhensigtsmæssig for at studere mikroaerofile C. jejuni end for andre enteriske patogener, der er fakultativt anaerobe. Mens C. jejuni er anerkendt som en invasiv patogen, mekanismerne i C. jejuni invasion af tarmepitelceller (IECS) er stadig uklart 4,5. C. jejuni invasion har vist sig at være afhængig af enten mikrofilamenter, mikrotubuli, en kombination af begge eller ingen af 5. Forvirringen på dette område er sandsynligvis på grund af brugen af uhensigtsmæssig in vitro assay forhold.
Et antal forskellige cellekultur assays er blevet anvendt til at undersøge samspillet C. jejunimed værtsceller. Caco-2 6, har INT 407 7, og T84 8 cellelinier blevet benyttet til at undersøge adhæsion og invasion kapaciteter forskellig C. jejuni stammer. Men niveauet af bakteriel adhæsion og invasion for C. jejuni med IECS er dramatisk lavere end for andre enteriske patogener 9.. Den coculturing C. jejuni med IECS normalt udføres i en CO 2 inkubator under forhold tæt på atmosfærisk ilt niveauer, der kræves for overlevelse IECS. C. jejuni genekspression vil være meget forskellig i den lave ilt miljø tarmens lumen i forhold til luftens ilt forhold.
Anvendelsen af en vertikal diffusion Chamber (VDC) system er blevet udviklet, som tillader cokultur af bakterier og værtsceller under andet medium og gassen 1,10,11. Dette system efterligner betingelserne i den menneskelige tarm, hvor bakterierne vil være unDER betingelser med lavt oxygenindhold, mens væv vil blive leveret med ilt fra blodet. Polariserede IEC monolag dyrket i særlige 0.4 um filtre blev anbragt i en VDC skabe en apikal og basolaterale rum, som blev individuelt fyldt med bakteriel bouillon og celledyrkningsmedium (figur 1). VDC blev anbragt i den variable atmosfæren inkubator indeholdende 85% N2, 5% O2 og 10% CO2 ved 37 ° C, der repræsenterer optimale forhold for C. jejuni. Den apikale rum blev efterladt åbne og udsat for mikroaerobe atmosfære i den variable atmosfære kuvøse, mens den forseglede basolaterale rum blev leveret med oxygen ved konstant administration af 5% CO 2/95% O 2 gasblanding med et udløbsrør forhindrer ophobning af tryk . Caco-2-celle overlevelse og monolag integritet under disse betingelser blev bekræftet ved at overvåge transepithelial electrical modstand (TEER) over monolaget på over 24 timer at demonstrere overlevelse Caco-2 cellemonolag og fysisk adskillelse af de apikale og basolaterale rum under iltmangel i det apikale rum. Den TEER af monolag i VDCer holdes i variablen atmosfære inkubator (mikroaerobe betingelser) og i et standard cellekultur CO2-inkubator (aerobe forhold) viste ingen signifikante forskelle, hvilket indikerer integritet af cellemonolaget under forskellige atmosfæriske betingelser 1.. Under mikroaerobe forhold forblev stramme vejkryds stede og jævnt fordelt mellem cellekanterne med en occludin farvning mønster, der svarer til celler opretholdt under aerobe betingelser 1..
Interaktionerne af C. jejuni med Caco-2 og T84 celler i VDC blev undersøgt ved at vurdere bakteriel vekselvirkning (adhæsion og invasion) og invasion. To forskellige C. jejuni vildtype strains blev anvendt 1. C. jejuni 11168H er en hypermotile derivat af den oprindelige sekvens stamme NCTC11168. Den 11168H stammen viser meget højere kolonisering niveauer i en chick kolonisering model og derfor betragtes som et passende belastning at bruge for værtspatogene interaktionsundersøgelser. 81-176 er et menneske isolere og er en af de mest invasive almindeligt undersøgte laboratoriestammer. C. jejuni stammer blev tilsat til den apikale rum i en VDC under enten mikroaerobe eller aerobe betingelser. Vi observerede højere satser for både interaktion og invasion blev registreret for C. jejuni under mikroaerobe betingelser 1.. Den øgede C. jejuni interaktioner ikke var på grund af en stigning i antallet af bakterier under mikroaerobe betingelser 1.. Disse data understøtter vores hypotese, at den lave ilt miljø i det apikale rum i VDC forbedrer bakterier-vært interaktioner og viser, at de invasive egenskaber af C. jejuni er Incrlempet under disse betingelser. Dette var den første rapport om anvendelsen af VDC model til at studere en invasiv bakterielt patogen og fremhæver betydningen af at udføre in vitro infektion assays under forhold, der i højere grad efterligner in vivo situation. VDC model kunne anvendes til at studere værtspatogene interaktioner for mange forskellige bakteriearter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anvendelsen af in vitro cellekultur metoder til at studere vekselvirkninger bakterielle patogener med værtsceller er en teknik almindeligt anvendt i mange forskningslaboratorier. Men sådanne celledyrkningsassays udføres under aerobe betingelser, disse in vitro-modeller kan ikke nøjagtigt repræsentere in vivo miljø, i hvilket værtspatogene interaktioner finder sted. Den udbredte in vitro infektion modeller er særligt uhensigtsmæssigt for at studere mikroaerofile C. jejuni<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dominic Mills blev understøttet af en Bloomsbury Colleges PhD Studentship (2007-2010). Forfatterne vil gerne takke både Ozan Gundogdu og Abdi Elmi for deres bistand til at udvikle VDC modellen.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
- Mills, D. C., et al. Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment. Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).
- Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465, 355-358 (2010).
- Dorrell, N., Wren, B. W. The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).
- Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).
- Hu, L., Kopecko, D. J., Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. Chapter 17. Campylobacter. , 297-313 (2008).
- Everest, P. H., et al. Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli. J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).
- Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures. Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).
- Monteville, M. R., Konkel, M. E. Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface. Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).
- Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms. J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).
- Schuller, S., Phillips, A. D. Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells. Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).
- Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling. J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).
