哺乳动物的外皮含有溶剂萃取的油脂,可以提供单个物种的化学成分特征。本文提出了分离外皮组织中分离出广阔的类脂质采用薄层色谱法,测定甘油三酯轮廓由飞行时间的基质辅助激光解吸/离子化质谱常规方法。
哺乳动物的体壁包括分泌的油性材料涂敷到皮肤表面皮脂腺。皮脂分泌是先天免疫系统,它是保护性对抗病原微生物的一部分。不正常的皮脂分泌和化学成分也是特定的皮肤疾病的临床症状。皮脂包含脂类,包括三酰基甘油酯,它是物种特异性的复杂混合物。通过多样化的脂质类的展出广泛的化学性质阻碍了具体确定的皮脂成分。分析技术的脂类通常需要化学衍生化是劳动密集和提高样品制备成本。本文介绍了如何从哺乳动物的体壁,独立广阔的类脂质薄层色谱法提取油脂,并用飞行时间的基质辅助激光解吸/离子化质谱分析的三酸甘油酯含量。这一功能强大的方法使直接测定的物种和个体间的三酰基甘油酯的档案,并且它可以很容易地应用到哺乳动物的任何分类群组。
哺乳动物的外皮组织包括表皮,角质层结构( 例如头发和指甲)和外分泌腺。皮脂腺型外分泌腺与毛囊,它们统称为毛囊皮脂腺单元1相关联。皮脂腺释放油状渗出到被称为皮脂在皮肤表面。皮脂主要由甘油脂( 如三酰甘油酯[标签]),游离脂肪酸酰基(远期运费协议),甾醇/蜡酯和角鲨烯。皮脂的化学成分是种属特异性2。除了 是先天免疫系统的一部分,并提供抗菌功能3,皮脂腺的油脂会影响重要的生理过程,包括蒸发失水通过皮肤4,细胞的完整性和基因调控5,和药物的吸收6。皮脂腺脂质组合物还可以作为疾病标志物。改变比例和皮脂腺的B值道路脂质类的疾病,例如痤疮7,头皮屑8,脂溢性皮炎8,皮脂缺乏症9,其中包括10个临床体征。表皮和毛发组织包括含有甾醇及其衍生物,标记,游离脂肪酸,神经酰胺,磷脂,和其他小脂质成分变量配置文件。因为外皮脂类可以在疾病过程中发挥作用,决定在健康和患病个体之间的TAG的化学成分差异可能是疾病的临床诊断。
脂质一般定义为不溶于水的有机化合物与任何非极性或极性-极性取代基11。脂质结构可以是长链烃,含氧烷烃(包括蜡酯,游离脂肪酸,醇类,酮类和醛类),或复杂的环状结构,例如胆固醇12。有脂质基于结构八大类别(远期运费协议,glycerolipiDS [GL],甘油[GP],鞘脂[SP],甾醇脂类[ST],异戊烯醇脂[PR],糖脂[SL],和聚酮[PK]),其中展出范围广泛的化学性质取决于类13。由于脂类的化学性质变化范围很宽,直接仿形未经脂质分子前衍生化是需要的。在脂质研究一种新兴的方法是薄层色谱(TLC)结合飞行时间的基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-TOF MS)14。
MALDI-TOF MS广泛用于蛋白质组研究,以确定蛋白质和它们的特定的氨基酸序列由于从胰蛋白酶消化的蛋白15产生的高度精确的肽离子的质量“指纹”相关联。 MALDI-TOF MS也可用于分析其他生物分子类,包括脂类如变量16-18。 MALDI需要使用一个矩阵,典型值售货机,ically包含芳族和共轭双键结构的有机化合物。基质分子起到激光的能量轻轻转移到分析物,促进质子转移,并产生单电荷的气相离子19-21。离子经受高压电场在高真空下和加速进入一个TOF质谱分析仪,其中离子随后通过在速度正比于它们的质荷比的差异分离。即使是非常大的生物分子可以与小碎片被电离,产生单电荷的分子离子物种简化频谱分析。直接分析脂质分子,恕不另行衍生的能力,促进了准备采用MALDI-TOF MS的脂质组研究18。
本文提出了一种常规方法,从头发分离和分析外皮脂质,皮脂分泌物和东方红蝙蝠plagiopatagium(Lasiurus BOREALIS)。这是用来确定在蝙蝠外皮间血脂变化,以阐明白鼻子综合症(WNS)22疾病的进程。 WNS是蝙蝠的甲真菌病,是由新近被描述的嗜冷物种Geomyces destructans 23-25。 WNS已造成超过500万的北美洞穴 蝙蝠的死亡并威胁脆弱的蝙蝠物种的灭绝,随着数十亿美元的损失,以农业产业26,27潜在的经济影响。为了研究在G的步骤destructans感染,脂质,从东方红蝙蝠的头发和机翼组织中提取并分离为广义的类脂质薄层色谱分离的TAG部分以供后续分析通过MALDI-TOF MS分析。标记包含短酰基链,很容易通过MALDI-TOF质谱检测很少基质干扰。
本文提出了分离分离哺乳动物珠被用制备TLC广泛的脂质类和MALDI-TOF MS测定TAG配置文件的简单而可靠的方法,而不脂质分子耗时衍生。生产标记与MALDI-TOF MS的谱图质量的关键步骤包括:1)成功提取以最小的污染或氧化的化合物; 2)足够的分离和隔离用色谱法,以及通过MALDI-TOF 3)高分辨率和质量精度MS。
本文从东方红蝙蝠的plagiopatagium提取分离中性脂质成分得到TAG MS配置文件说明了方法。虽然本研究采用了蝙蝠(哺乳纲:翼手),这些方法可以扩展到任何研究哺乳动物的外皮血脂。蝙蝠外皮的特征在于主要是胆固醇,用较少量的标记,游离脂肪酸,鳞状溶解乙炔和甾醇/蜡酯。在蝙蝠皮脂脂质比率从人类中角鲨烯的不同是存在于少量(相对于在人类中高达16%),而胆固醇发生在较大的比例(1 -在人类中的7%,但26 -蝙蝠62%)22 ,31。人的头发含有约3%的标签,而比例高达28%被发现在东方红蝙蝠的头发。脂质样品从蝙蝠的提取是相似的其他物种。而在本研究中浸泡在溶剂棉球用于去除皮脂,1也可以颠倒含有溶剂的小瓶或试样管上的珠被多次的表面上。专用胶带产品还提供其他方法来提取表面脂类32。适当的脂质提取的一个关键部分是从皮肤出油减少污染。这是很容易保持挤压瓶用甲醇和喷涂所有玻璃器皿和餐具,擦餐具与所有样品和戴手套检查之间的组织来完成。氧化Øf多不饱和酰基,防止通过加入BHT和它应该不管样本被存储在该温度下的使用。
生物分子分析通常需要一个色谱步骤,感兴趣的污染物分离分子。 TLC是用在此方法中,避免了对气体或液体色谱仪的要求和需要较少的技术经验来实现健壮的和可重复的结果。取决于感兴趣的脂质类,许多不同的流动相可被并入。此外,使用HPTLC板和扫描光密度的可用于实现定量结果。虽然薄层色谱方法的变化更是不胜枚举,在这里列出,在脂质薄层色谱中常用的一些流动相:氯仿:甲醇:水为磷脂和糖脂或异辛烷的分离:乙醚的非极性脂类28分。在分离等类脂质,其H TAG的方面:E:A这样lvent系统都能正常工作,并提供可比较的结果。
采用薄层色谱法的另一个优点是所关注频带可以用MALDI-TOF MS没有被分析物的衍生化之前被快速成型。在这项研究中,二氧化硅被从TLC板上除去,且分析物从它在一种溶剂和随后的离心分离,洗脱溶剂中的吸附剂和蒸发洗脱通过超声处理。或者,基质可以直接施加到分离的TLC板,然后直接通过MALDI-TOF MS分析33的分析物条带。分析成功通过MALDI-TOF MS有依靠足够的样品制备和操作者的熟练程度与调谐和校准仪器。仪器应每天用覆盖分子量范围适用于感兴趣的分子的标准进行校准。该设备的合适的灵敏度和分辨率( 例如 ≥10,000)也应confirme每天用ACTHÐ。
哺乳动物的体壁表面上发现的皮脂腺脂质成分可能是由细菌/真菌病原体的定植起到一定的作用。因此,物种和个体间的化学成分的知识可以提供关于人类和野生动物的疾病过程的线索。患病和健康人之间的种内差异可能代表临床症状,援助在疾病检测和诊断。此外,如果能抑制微生物生长的特定化合物存在时,它们可以被识别为在疾病的治疗和预防用途。
The authors have nothing to disclose.
援助的实验室方法的发展过程中所提供的斯科特·特里斯,凯特琳阿尔特,杰里米Ragsdell,托尼·拉马克詹姆斯,艾米菲舍尔,汉娜·布莱尔,和夏延杰兹。我们要感谢麦地那 – 玻利瓦尔实验室(路易斯·H.老圃奥拉沙宝;阿肯色州生物科学研究所),用于与薄层扫描密度援助。阿肯色州资产倡议P3中心(EPS-0701890)在阿肯色州生物科学研究所:MALDI-TOF MS用于该项目通过了NSF州EPSCoR,RII提供了依据。经费是由美国渔业和野生动物服务/阿肯色州野生动物格兰特,全国的洞穴协会和中心的北美蝙蝠保育研究在美国印第安纳州立大学提供。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals, LLC | 101162 | www.mpbio.com |
TLC Flexible Plates | Whatman | 4410-222 | www.whatman.com |
ACTH | Sigma-Aldrich Chem. Co. | A8346-5X1VL | www.sigmaaldrich.com |
Triolein | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 44895-U | |
TLC Lipid Standard | TLC 18-1 | www.nu-chekprep.com | |
MALDI TAG Standard | Nu-Check Prep., Inc. | NIH Code 53B | |
MALDI TAG Standard | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 17810-1AMP-S | |
Glass Vials with Teflon Cap | U.S. National Scientific Co. | B7800-2 | www.nationalscientific.com/ |
DHB | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 50862-1G-F | |
CHCA | Sigma-Aldrich Chem. Co. | C8982-10X10 mg | |
Sebutape | CuDerm | S100 |