Procédure à suivre pour le développement de la multi-profondeur circulaire transversale endothélialisées microcanaux-on-a-chip

Résumé

Une plate-forme microcanaux-on-a-chip a été développé par la combinaison de la technique de photolithographie reflowable de résine photosensible, lithographie douce, et la microfluidique. La plate-forme de micro-canaux endothélialisée imite la géométrie en trois dimensions (3D) des microvaisseaux in vivo, fonctionne sous débit de perfusion continue contrôlée, permet l'imagerie de haute qualité et en temps réel et peut être appliqué pour la recherche microvasculaire.

Résumé

Des efforts ont été concentrés sur le développement des essais in vitro pour l'étude des micro-vaisseaux parce que in vivo les études animales sont plus chronophage, coûteux, et l'observation et la quantification sont très difficiles. Cependant, classique dans des essais in vitro microvaisseaux ont des limites lorsqu'il s'agit de représenter in vivo microvaisseaux par rapport à la géométrie en trois dimensions (3D) et fournir un flux continu de fluide. En utilisant une combinaison de la technique de photolithographie reflowable de résine photosensible, lithographie douce, et microfluidique, nous avons développé une multi-profondeur endothélialisées transversales circulaires microcanaux-on-a-chip, qui imite la géométrie 3D in vivo microvaisseaux et fonctionne sous perfusion continue contrôlée écoulement. Une résine photosensible refusionnable positif a été utilisé pour fabriquer un moule maître à un réseau de microcanaux de section transversale semi-circulaire. Par l'alignement et le collage des deux (PDMS) microcanaux polydiméthylsiloxane replicated du moule maître, un réseau de micro-canal cylindrique a été créé. Les diamètres des microcanaux peuvent être bien contrôlés. De plus, la veine ombilicale cellules endothéliales humaines primaires (HUVEC) ensemencées à l'intérieur de la puce ont montré que les cellules alignées de la surface intérieure des micro-canaux sous perfusion contrôlée durant pendant une période de temps entre 4 jours à 2 semaines.

Introduction

Microvaisseaux, comme une partie du système de circulation, la médiation des interactions entre le sang et les tissus, soutenir les activités métaboliques, définir microenvironnement tissulaire et jouent un rôle essentiel dans de nombreuses conditions pathologiques et de santé. Récapitulation des microvaisseaux fonctionnelles in vitro pourrait fournir une plate-forme pour l'étude des phénomènes vasculaires complexes. Cependant, classique dans des essais microvaisseaux in vitro, tels que les tests endothéliales de cellules de migration, des tests de formation de tubes endothéliaux et des analyses d'anneau aortique chez le rat et la s....

Protocole

1. Photolithographie Fabrication de Photoresist moule maître

Le protocole suivant montre le processus pour fabriquer des microcanaux avec des diamètres compris entre 30-60 um. Pour obtenir un micro-canal avec un diamètre plus faible (inférieure à 30 pm), un seul dépôt par centrifugation de résine photosensible est nécessaire.

1. Transférer la résine photosensible de refusion du réfrigérateur à 4 ° C à la salle blanche 24 heures avant de l'utiliser et de le laisser se réchauffer à température ambiante.
2. Nettoyer une plaquette de silicium et faire cuire pendant une heure à 150 ° C pour lui permettre de se déshydrater. L....

Résultats

Notre méthode pour fabriquer le réseau de microcanaux à plusieurs profondeur imite les géométries 3D complexes in vivo des microvaisseaux, dans lequel les micro-canaux ont des sections transversales arrondies ^15. En outre, les diamètres des parents canaux de dérivation et les canaux de fille d'environ obéissent à la loi de Murray pour le maintien de l'écoulement du fluide à un niveau requis de sorte que la résistance globale du canal est faible et les vitesses d'écoulement sont plus unifo.......

Discussion

1. Maître fabrication de moule

L'un des principes directeurs pour la conception et la morphométrie vasculaire est connue comme la loi de Murray ^16, qui stipule que la distribution de diamètre des vaisseaux dans tout le réseau est régi par des considérations d'énergie minimale. Il indique également que le cube des diamètres d'un vaisseau mère à une bifurcation est égale à la somme des cubes des diamètres des vaisseaux fille (

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
réactif/matériau
refusion Photoresist	AZ Electronic Materials AZP4620
Developer	AZ Electronic Materials AZ	400K
PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
MCDB 131 Milieu de culture	Invitrogen	10372-019
NacBlue Nuclei Staining	Invitrogen	H1399
PKH Red Stain	Sigma	MINI26 et PKH26GL
Fibronectin	Gibco	PHE0023
L-Glutamine	Sigma	G7513
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	14040-133
HEPES Buffered Saline Solution	Lonza	CC-5024
Trypsine/EDTA	Invitrogen	25300-062
Solution neutralisante de trypsine	Lonza	CC-5002
PDMS Agent de durcissement	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Cellules endothéliales primaires de la veine ombilicale humaine	Lonza	CC-2517
Sérum de veau fœtal	Lonza	14-501F
Diluant C	Sigma	CGLDIL
Hoechst33342	Invitrogen, Sondes moléculaires	R37605
Dextran	Sigma	95771
Microscopie	3,5 % paraformaldéhyde	15710-S
Equipment
Spinner	Laurell Technologies Corporation	WS-400BZ-6NPP/ Dessiccateur LITE
	BelArt Products	999320237
Microscope inversé	Nikon	Eclipse Ti
Système de pompe à seringue	Appareil de Harvard	PHD Ultra
Laminar Biosafety Hood	Thermo Scientific	1300 Series A2
Mélangeur centrifuge planétaire	Thinky	ARE-310
Four Isotemp	Fisher Scientific	13-246-516GAQ
Microscope optique	Zeiss	Invertoskop 40C
Nettoyeur plasma	Harrick Plasma	PDC-32G
Plaque chauffante	Barnstead/Thermolyne Cimarec	SP131635
Microscope confocal à balayage laser	Zeiss	LSM 510

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