Summary

Microfluidic תגובת Capture-חיי בן אשר על השבב כדי לשתק הפיך מולקולות קטנות או מבני Multi-רכיב עבור יישומי Biosensor

Published: September 23, 2013
doi:

Summary

אנו מציגים שיטה לקיבוע מהיר, הפיך של מולקולות קטנות והרכבות nanoparticle פונקציונליות ללימודי Surface Plasmon התהודה (SPR), תוך שימוש רציף לכידת הכימיה cycloaddition bioorthogonal ונוגדן אנטיגן על השבב.

Abstract

שיטות לקיבוע משטח מהיר של מולקולות קטנות ביו עם שליטה על התמצאות וצפיפות חוסר תנועה הן רצויות מאוד עבור יישומי biosensor וmicroarray. במחקר זה, אנו משתמשים bioorthogonal יעיל ביותר קוולנטיים [4 +2] תגובת cycloaddition בין טרנס cyclooctene (TCO) ו1,2,4,5-tetrazine (טז) על מנת לאפשר קיבוע microfluidic של מולקולות derivatized-TZ TCO / . אנו מנטרים את התהליך בזמן אמת בתנאי זרימה רציפים באמצעות התהודה plasmon פני השטח (SPR). כדי לאפשר קיבוע הפיך ולהרחיב את טווח הניסוי של פני השטח החיישן, אנו משלבים רכיב ללכוד אנטיגן נוגדן שאינו קוולנטיים עם תגובת cycloaddition. על ידי לסירוגין הצגת moieties TCO או Tz למשטח החיישן, תהליכי הלכידה-cycloaddition מרובים הם עכשיו אפשריים על משטח חיישן אחד ללימודי הרכבה ואינטראקציה על השבב של מגוון רחב של מבנים מרובים רכיבים. אנו illustrate שיטה זו עם שני ניסויים שונים קיבוע על שבב biosensor; מולקולה קטנה, AP1497 שנקשר חלבון קושר FK506 12 (FKBP12); ואותה מולקולה קטנה, כחלק מnanoparticle פונקציונליות אתרו משותק וב.

Introduction

תגובות נטיה יעילה הן כלים רבי ערך לחיבור מולקולות ביו למשטחים עבור מגוון רחב של יישומים בתחום הביוטכנולוגיה. לאחרונה, bioorthogonal מהר מאוד [4 +2] תגובת cycloaddition בין טרנס cyclooctene (TCO) ו1,2,4,5-tetrazine (טז) כבר משמשים תווית משטחי תאים, מבני subcellular, נוגדנים וחלקיקים 1. – 7 כאן, אנו משתמשים תגובת cycloaddition [4 +2] בשילוב עם לכידת אנטיגן / נוגדן (GST / אנטי GST) להפיכה סינתזה של מבנים רב רכיב למשטח Plasmon תהודה (SPR) ניתוח אינטראקציה על השבב ולעקוב אחר תהליך בזמן אמת (איור 1). 8,9 יש לציין, האסטרטגיה ללכוד חיי בן אשר מאפשרת התחדשות פני השטח באמצעות פרוטוקול מבוסס. 8 כתוצאה מכך, הרכבה של משטחי חיישן יציבים עם שליטה על נטייה ליגנד וצפיפות עבור מגוון רחב של assay החדש פורמטים אפשרי עכשיו. באמצעותאסטרטגיה זו אנו מדגימים את חוסר התנועה של מולקולות קטנות derivatized-TZ TCO / ומאפיינים את חיי בן אשר שיעורים במגוון רחב של תנאי חיץ. אנחנו בחרנו באינטראקציה הידועה בין FKBP12 וAP1497 מולקולה נקשרת FKBP12 10-12 לדוגמא ירושלים כדי לוודא שהאסטרטגיה ללכוד cycloaddition משמרת את יכולתה של המולקולה הקטנה לאינטראקציה עם היעד שלה, כאשר גם מחובר ישירות לאנטיגנים GST משותקים או לחלקיקים משותקים (NPS).

שיטה זו מציעה מספר יתרונות. ראשית, חוסר התנועה הפיכה של מולקולות קטנות על שבבי חיישן אפשרי עכשיו. שנית, חוסר תנועת TCO / Tz של מולקולות קטנות גם מאפשר מחקרי אינטראקציה ללא תווית שלהפוך את הכיוון של מחקרי SPR הקנונית, ועשויה לספק תצוגה משלימה של אינטראקציה מחייבת. שלישית, שיטה זו מאפשרת את סינתזת microfluidic של חלקיקים ממוקדים, והערכה מיידית של bindinמאפיינים גרם. זה מבטיח לשפר את היעילות של הערכה או הקרנת חלקיקים ממוקדים, וגם להקטין את הכמויות של חלקיקים הנדרשים. 13-15 הרביעית, גישה זו יכולה למדוד קינטיקה התגובה של תגובות cycloaddition bioorthogonal בזמן אמת תחת זרימה רציפה. לבסוף, הכימיה קיבוע TCO / TZ היא חזקה בנוכחותו של סרום. יחדיו, אנו צופים כי גישה תכליתית זו תהיה רחבה להקל על הבנייה של משטחי חיישן יציבים למגוון רחב של מחקרי microfluidic עם שייכות במבחנה וביישומים סלולריים vivo.

Protocol

1. הכנת GST וNanoparticle (NP) Conjugates הכנת GST-TCO: הוסף 8 μl של פתרון TCO-NHS (50 מ"מ DMSO) לשל GST (1 מ"ג / מיליליטר PBS) 100 μl ולנער את התערובת על RT במשך שעה 1. הסר מגיב…

Representative Results

נתונים ודמויות הותאמו מהתייחסות 8. חוסר תנועה הפיכה יעילה של מולקולות קטנות, ביו עם שליטה על התמצאות וצפיפות ממלאת תפקיד מרכזי בפיתוח של יישומי biosensor חדשים. באמצעות תגובת bioorthogonal מהירה בין TCO וTz, אנו מתארים שיטה להרכבה בשלבים וההתח…

Discussion

שיטת הלכידה-cycloaddition המתואר כאן מאפשרת קיבוע מהיר, הפיך של חלקיקים שונה ומולקולות קטנות לאינטראקציה מבוססת שבב ללא תווית ומחקרים קינטית. פרוטוקול הקיבוע ניתן לבצע בדקות דורשות <10 מיקרומטר ריכוזים של ligands מולקולה קטנה. על ידי ויסות ריכוז ליגנד וצפיפויות קיבוע זמן מגע…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מכירים במימון מ-NIH (NHLBI חוזה מס 'HHSN268201000044C לRW, SH וSYS).

Materials

Reagent
Sensor Chip CM5 GE Healthcare BR-1005-30
Amine coupling kit GE Healthcare BR-1000-50
GST capture kit GE Healthcare BR-1002-23
NAP-10 Columns GE Healthcare 17-0854-01
GST, lyophilized in 1X PBS Genscript Z02039 1 mg/ml
rhFKBP12 R&D Systems 3777-FK
Surfactant P-20 GE Healthcare BR-1000-54
Glycine 2.0 GE Healthcare BR-1003-55
Zeba spin desalting column Thermo 89882 7 K MWCO
Amicon Ultra 4 Fisher UFC810096 100 K centrifugal filter
TCO-OH Ref. 8 Synthesized in-house
TCO-NHS Ref. 8 Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2 Ref. 8 Synthesized in-house
Tz-NHS Ref. 8 764701 Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2 Ref. 8 Synthesized in-house
AP1497, AP1497-Tz Ref. 8 Synthesized in-house
Equipment
SPR Biosensor GE Healthcare Biacore T100

References

  1. Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
  2. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
  3. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
  4. Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
  5. Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
  6. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
  7. Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
  8. Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
  9. Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
  10. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
  11. Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
  12. Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
  13. Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
  14. Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
  15. Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
  16. Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
  17. Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
  18. Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
  19. Mammen, M., Choi, S. -. K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
  20. Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
  21. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
  22. Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
  23. Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
  24. GE Healthcare. . Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , (2005).

Play Video

Citer Cet Article
Tassa, C., Liong, M., Hilderbrand, S., Sandler, J. E., Reiner, T., Keliher, E. J., Weissleder, R., Shaw, S. Y. Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications. J. Vis. Exp. (79), e50772, doi:10.3791/50772 (2013).

View Video