Microfluidic תגובת Capture-חיי בן אשר על השבב כדי לשתק הפיך מולקולות קטנות או מבני Multi-רכיב עבור יישומי Biosensor
Summary
אנו מציגים שיטה לקיבוע מהיר, הפיך של מולקולות קטנות והרכבות nanoparticle פונקציונליות ללימודי Surface Plasmon התהודה (SPR), תוך שימוש רציף לכידת הכימיה cycloaddition bioorthogonal ונוגדן אנטיגן על השבב.
Abstract
שיטות לקיבוע משטח מהיר של מולקולות קטנות ביו עם שליטה על התמצאות וצפיפות חוסר תנועה הן רצויות מאוד עבור יישומי biosensor וmicroarray. במחקר זה, אנו משתמשים bioorthogonal יעיל ביותר קוולנטיים [4 +2] תגובת cycloaddition בין טרנס cyclooctene (TCO) ו1,2,4,5-tetrazine (טז) על מנת לאפשר קיבוע microfluidic של מולקולות derivatized-TZ TCO / . אנו מנטרים את התהליך בזמן אמת בתנאי זרימה רציפים באמצעות התהודה plasmon פני השטח (SPR). כדי לאפשר קיבוע הפיך ולהרחיב את טווח הניסוי של פני השטח החיישן, אנו משלבים רכיב ללכוד אנטיגן נוגדן שאינו קוולנטיים עם תגובת cycloaddition. על ידי לסירוגין הצגת moieties TCO או Tz למשטח החיישן, תהליכי הלכידה-cycloaddition מרובים הם עכשיו אפשריים על משטח חיישן אחד ללימודי הרכבה ואינטראקציה על השבב של מגוון רחב של מבנים מרובים רכיבים. אנו illustrate שיטה זו עם שני ניסויים שונים קיבוע על שבב biosensor; מולקולה קטנה, AP1497 שנקשר חלבון קושר FK506 12 (FKBP12); ואותה מולקולה קטנה, כחלק מnanoparticle פונקציונליות אתרו משותק וב.
Introduction
תגובות נטיה יעילה הן כלים רבי ערך לחיבור מולקולות ביו למשטחים עבור מגוון רחב של יישומים בתחום הביוטכנולוגיה. לאחרונה, bioorthogonal מהר מאוד [4 +2] תגובת cycloaddition בין טרנס cyclooctene (TCO) ו1,2,4,5-tetrazine (טז) כבר משמשים תווית משטחי תאים, מבני subcellular, נוגדנים וחלקיקים 1. – 7 כאן, אנו משתמשים תגובת cycloaddition [4 +2] בשילוב עם לכידת אנטיגן / נוגדן (GST / אנטי GST) להפיכה סינתזה של מבנים רב רכיב למשטח Plasmon תהודה (SPR) ניתוח אינטראקציה על השבב ולעקוב אחר תהליך בזמן אמת (איור 1). 8,9 יש לציין, האסטרטגיה ללכוד חיי בן אשר מאפשרת התחדשות פני השטח באמצעות פרוטוקול מבוסס. 8 כתוצאה מכך, הרכבה של משטחי חיישן יציבים עם שליטה על נטייה ליגנד וצפיפות עבור מגוון רחב של assay החדש פורמטים אפשרי עכשיו. באמצעותאסטרטגיה זו אנו מדגימים את חוסר התנועה של מולקולות קטנות derivatized-TZ TCO / ומאפיינים את חיי בן אשר שיעורים במגוון רחב של תנאי חיץ. אנחנו בחרנו באינטראקציה הידועה בין FKBP12 וAP1497 מולקולה נקשרת FKBP12 10-12 לדוגמא ירושלים כדי לוודא שהאסטרטגיה ללכוד cycloaddition משמרת את יכולתה של המולקולה הקטנה לאינטראקציה עם היעד שלה, כאשר גם מחובר ישירות לאנטיגנים GST משותקים או לחלקיקים משותקים (NPS).
שיטה זו מציעה מספר יתרונות. ראשית, חוסר התנועה הפיכה של מולקולות קטנות על שבבי חיישן אפשרי עכשיו. שנית, חוסר תנועת TCO / Tz של מולקולות קטנות גם מאפשר מחקרי אינטראקציה ללא תווית שלהפוך את הכיוון של מחקרי SPR הקנונית, ועשויה לספק תצוגה משלימה של אינטראקציה מחייבת. שלישית, שיטה זו מאפשרת את סינתזת microfluidic של חלקיקים ממוקדים, והערכה מיידית של bindinמאפיינים גרם. זה מבטיח לשפר את היעילות של הערכה או הקרנת חלקיקים ממוקדים, וגם להקטין את הכמויות של חלקיקים הנדרשים. 13-15 הרביעית, גישה זו יכולה למדוד קינטיקה התגובה של תגובות cycloaddition bioorthogonal בזמן אמת תחת זרימה רציפה. לבסוף, הכימיה קיבוע TCO / TZ היא חזקה בנוכחותו של סרום. יחדיו, אנו צופים כי גישה תכליתית זו תהיה רחבה להקל על הבנייה של משטחי חיישן יציבים למגוון רחב של מחקרי microfluidic עם שייכות במבחנה וביישומים סלולריים vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת הלכידה-cycloaddition המתואר כאן מאפשרת קיבוע מהיר, הפיך של חלקיקים שונה ומולקולות קטנות לאינטראקציה מבוססת שבב ללא תווית ומחקרים קינטית. פרוטוקול הקיבוע ניתן לבצע בדקות דורשות <10 מיקרומטר ריכוזים של ligands מולקולה קטנה. על ידי ויסות ריכוז ליגנד וצפיפויות קיבוע זמן מגע…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים במימון מ-NIH (NHLBI חוזה מס 'HHSN268201000044C לRW, SH וSYS).
Materials
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 |
References
- Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
- Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
- Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
- Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
- Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
- Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
- Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
- Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
- Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
- Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
- Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
- Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
- Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
- Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
- Mammen, M., Choi, S. -. K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
- Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
- Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
- Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
- GE Healthcare. . Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , (2005).
